仪器分析第四版高效液相色谱.ppt

1、第三章 高效液相色谱法 High Performance Liquid Chromatography,2,第一节、概述一、色谱法的定义,色谱法是一种分离方法。 它的特点是：有两相，一是固定相，一是流动相，两相作相向运动。,将色谱法用于分析中，则称为色谱分析。 色谱分析是一种分离、分析法。,3,二、色谱法分离原理,当流动相中所携带的混合物流过固定相时，就会和固定相发生作用(力的作用)。由于混合物中各组分在性质和结构上有差异，与固定相发生作用的大小也有差异。因此在同一推动力作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后不同的次序从固定相中流出。,4,三、色谱法的分类,按流动相状态的不同，

2、可分为,气相色谱法 (GC)以气体为流动相的色谱法 液相色谱法 (LC)以液体为流动相的色谱法 超临界流体色谱 (SFC),5,气相色谱法适合分离分析易汽化（在- 190-500范围内有0.2-10mmHg的蒸气压的）稳定、不易分解、不易反应的样品，特别适合用于同系物、同分异构体的分离。 液相色谱法适合分离分析高沸点、热不稳定、离子型的样品。,6,按固定相使用的形式可液相色谱法又可分为： 柱色谱（Column Chromatography） 将固定相装在色谱柱内 纸色谱（Paper Chromatography） 用滤纸做固定相或固定相载体的色谱 薄层色谱（Thin Lay Chromatog

3、raphy） 固定相均匀涂在玻璃板或塑料板上,四、高效液相色谱 （一）高效液相色谱（HPLC）含义： 高效能固体细微粒为固定相 高压溶剂为流动相 高灵敏度检测器,8,死时间(tM):完全不保留组分流出系统的时间 保留时间(tR): 调整保留时间(tR): 死体积(VM): 保留体积(VR): 调整保留体积(VR):,（二）高效液相色谱与其它色谱方法的比较,1. HPLC与经典LC的比较,2. HPLC与GC的比较,相同：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼具分离和分析功能，均可以在线检测,按固定相的聚集状态分类： 液-固色谱法 液-液色谱法 按分离机制分类： 分配色谱法 吸附色谱法 离子交换

4、色谱法 空间排阻色谱法,（三）HPLC分类,其它分离机制色谱法： 亲合色谱法 AC 胶束色谱法 MC 手性色谱法 CC 毛细管电色谱法 CEC,当前最常见的HPLC： 化学键合相色谱法（bonded phase chromatography),第二节 高效液相色谱仪,高压输液系统：储液器、吸滤器、高压 输液泵、脱气装置及梯度洗脱装置 进样系统：进样器，进样阀 分离系统：色谱柱，恒温箱 检测系统：检测器 记录系统：记录装置、色谱工作站,1、贮液器和吸滤器：,一、 高压输液系统,贮液器: 1-2L的玻璃瓶,溶剂吸滤器: Ni合金，孔约0.45 m，防止颗粒物进行泵内。,2、高压输液泵,要求,流量准

5、确可调、可调范围宽：流动相流速在0.5-2mL/min，输液泵的最大流量5-10mL/min 耐高压：输出压力常达30-60MPa 液流稳定。 结构材料应耐化学腐蚀,活塞型往复泵 液相色谱仪中使用最广泛的恒流泵,双活塞型往复泵,离线超声波振荡脱气 在线惰性气体鼓泡吹扫脱气 在线真空脱气装置,3、脱气装置 ：,将相对分子量小的气体从溶剂中除去,4、梯度洗脱装置：,为什么要进行梯度洗脱？,使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离,梯度洗脱：在分离过程中逐渐改变流动相组成，如溶剂的极性、离子强度、pH值等。,高压梯度： 用于二元梯度，用两个泵分别按 设定的比例输送A和B两溶液至

6、混合器 低压梯度： 只用一个高压泵，在泵前安装了一个 比例阀，混合就在比例阀中完成。,二、 进样系统,将样品溶液准确送入色谱柱的装置 手动方式、自动方式,密封性好、死体积小、重复性好、进样时引起色谱系统的压力和流量波动要很小。,进样器要求,常用手动进样器六通阀进样器，,三、 色谱柱,柱长1530cm，内径45mm,基质 (硅胶或高分子聚合物微球),功能层(固定在基质表面对样品分子保留起实质作用的有机分子或功能团),四、 检测系统,用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。,溶质性检测器：仅对被分离组分理化特性响应 紫外、荧光、电化学检测器,总体检测器：对试样和洗脱液总理化性质响

7、应 示差折光，电导检测器,四、 检测系统,1、紫外检测器,微量吸收池，光程为2-10mm, 体积约为110 L,最小检测量10-9gml-1 对流量和温度波动不敏感 可用于梯度洗脱。,最常用的通用型检测器,四、 检测系统,光电二极管阵列检测器,时间、光强度和波长三维谱,2、荧光检测器,四、 检测系统,灵敏度高 选择性好 样品量很小 适合药物和生化样品分析,3、蒸发光散射检测器,四、 检测系统,适于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测,通用型和质量型检测器,溶剂相和样品+溶剂相对光的折射率不同，造成两束光强度差变化，差示信号放大记录代表样品浓度 通用型检测器，灵敏度为10-7g/ml 对温

8、度变化敏感，且不适于梯度淋洗,4、示差折光检测器,四、 检测系统,5、安培检测器,利用待测物在工作电极表面发生反应产生电流，此电流大小与待测物浓度成正比。,流动相必须含电解质，且呈化学隋性。 只能检测具有电活性的物质。,四、 检测系统,五 、 数据处理和计算机控制系统,色谱工作站 在线显示 自动采集 处理储存 自动控制,1、要求： 粒径小、颗粒分布均匀 传质快、渗透压小 机械强度高、能耐高压 化学稳定性好,第三节、HPLC的固定相和流动相,一、固定相,一、固定相,（1） 按承受压力分 刚性固体：硅胶为基质 主要用于吸附、分配和键合色谱 硬 胶：以聚合物为基质 主要用于离子交换和尺寸排阻色谱,2

9、、固定相载体,（2）按孔隙深度分 表面多孔型：实心玻璃珠为基体，基体表面覆盖一层多孔活性材料 适于常规分离分析 全多孔型：全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成 适于复杂混合物的分离。,一、固定相,2、固定相载体,3. 常用固定相 液固色谱固定相 常用粒径310m，理论塔板数过 5 万/米 无定形全多孔硅胶：YWG 球形全多孔硅胶：YQG 高分子多孔微球：YSG,一、固定相,3. 常用固定相 化学键合固定相 以硅胶为载体，借化学反应方法将有机分子以共价键连接在硅醇基上,一、固定相,Si-O-R： 热不稳定、易水解，适于不含水或醇的流动相 Si-R(或Si-N)： 不水解，热稳定性较好。但格式反应不方便

10、。使用水溶液作流动相时，其pH应在4-8之间。 Si-O-Si-R： 不水解，热稳定性好，pH2-8范围内对水稳定,3. 常用固定相 化学键合固定相,一、固定相,3. 常用固定相 化学键合固定相 非极性键合相：十八烷基键合相（ODS，C18） 中等极性键合相：醚基键合相 极性键合相：氨基、氰基键合相,一、固定相,3. 常用固定相 其它固定相 离子交换固定相：离子交换树脂、键合型离子交换树脂 空间排阻色谱固定相：凝胶 手性固定相：手性官能团键合或天然手性物质固着在载体上如环糊精 亲合色谱固定相：生物专一性配基+载体,一、固定相,二、流动相淋洗液，洗脱剂,对样品有适宜溶解度， k = 2 5； 溶

11、剂要与检测器匹配。 高纯度、化学稳定性好 适宜的粘度。过高柱压增加；过低易生气泡,1、流动相要求,常用的低粘度溶剂：甲醇、乙腈等 粘度过低的溶剂：戊烷、乙醚等,2、流动相组成,按组成不同：单组分和多组分； 按极性：极性、弱极性、非极性； 按使用方式：固定组成淋洗和梯度淋洗。,二元或多元组合溶剂可灵活调节流动相极性,常用溶剂: 四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、甲醇、水。,二、流动相淋洗液，洗脱剂,正相色谱：极性固定相非极性流动相（加极性调节剂如氯仿）极性柱（正相柱）,三、固定相和流动相的选择,反相色谱：非极性键合固定相（ODS）极性流动相非极性柱（反相柱）,组分在两种类型分离柱上的出峰顺序

12、相反。,流动相可选水或一定pH缓冲液，加甲醇或乙腈调节极性）,42,死时间(tM):完全不保留组分流出系统的时间 保留时间(tR):物质从进样开始到检测到信号所需时间 调整保留时间(tR): 死体积(VM): 保留体积(VR): 调整保留体积(VR):,四、描述HPLC色谱相关概念 基线，峰，峰高，峰宽，峰面积,正、反相色谱中极性和保留时间的关系,44,R: 分离度 tR: 保留时间 t0：死时间 W：峰底宽度,五. 色谱分离基本方程 （一）分离度（R） 反映的是相邻两个峰的分开程度,45,不同R值时 峰重叠情况示意图,R1.5可以得到基线分离 R太小，两个峰无法彻底分离 R太大，分离时间过长

13、，工作效率低下 一般要求R1.5，也可遵循行业特殊规定,46,其中： n:理论塔板 ：分离选择性因子， K:分配系数 根据该公式优化试验条件，提高分离度R。 从数学推导来看，分别增大n，k值，都可以提高分离度。,（二）色谱分离基本方程,1、选择因子,在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值，此时可用符号表示，即 = tr (i) / tr (s) 式中tr (i)为后出峰的调整保留时间，所以总是大于1的。 相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子。,48,分离选择性（）对分离度（R）的影响,如果t0=1min,=1.64/1.58

14、=1.04, =1.15/0.85=1.35, =0.95/0.63=1.50,改变分离选择性的方法 改用不同的流动相 改变流动相的组成 并非必须大于1.5！ 改变流动相pH值 尽量优化前几种实验条件提高a值， 改变柱温 避免改变固定相（买新柱子），以便降低成本 应用特殊的化学效应 改变固定相,2、分配系数K,指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即 K=溶质在固定相中的浓度 / 溶质在流动相中的浓度 = Cs / Cm 分配系数是由组分和固定相的热力学性质决定的，它是每一个溶质的特征值，它仅与三个变量有关：固定相、流动相和温度。与两相体积、柱管的特性以及所使

15、用的仪器无关,50,3、理论塔板数和理论塔板高度的计算方法,理论塔板数 理论塔板高度HETP=L/n 理论塔板数n越大，柱效越高；理论塔高度HETP越小，柱效越高,51,柱效（n）对分离度（R）的影响,以上两张谱图k，, 值完全相同，仅仅由于柱效高低不同使得它们具有不同的分离度。 直观的看，峰的尖锐程度代表了柱效高低，峰越尖锐，其柱效越高，通常使用理论塔板数（n）的大小衡量柱效的高低,52,4、容量因子（k）对分离度（R）的影响,容量因子越大，分离度越大。 k 1 3 5 7 9 11 13 k/k+1 0.50 0.75 0.83 0.88 0.90 0.92 0.93 1.00 但当容量因

16、子大于10，k/(k+1)的改变不大，而分析时间将大大延长。因此，k的最佳范围是1k20。,改变容量因子的方法有： 改变柱温 改变柱死体积，其中死体积对k/(k+1)的影响很大。 改变流动相的配比是最简便、最有效的方法 梯度洗提,容量因子,六、色谱分离速率方程 范第姆特方程（Van Deemter equation）,在高效液相色谱中, 速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，而只有两项，即： H = A + C u,H为塔板数， A为涡流扩散系数， B为纵向扩散系数， C为传质阻抗系数， 为流动相流速。,第四节 HPLC分离条件的选择,根据van Deemter方程和色谱分离方程式选

17、择分析条件,在高效液相色谱中, 速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，而只有两项，即： H = A + C u,（1）固定相： 粒度小，均匀，以减小涡流扩散和流动相传质阻力； 改进结构，采用大孔径和浅孔道的表面多孔型载体或全多孔微粒型载体，减少滞留流动相传质阻力。,第四节 HPLC分离条件的选择,（2）流动相： 低粘度的流动相增大组分 在溶剂中的扩散系数Dm减少传质阻力 （3）流速： 最佳流速在流速很小处，减小流速有利提高柱效 常采用比最佳流速高数倍的流速加快分析速度,第四节 HPLC分离条件的选择,（4）柱温： 提高柱温降低流动相粘度减少传质阻力分辨率降低，柱寿命短，易产生气泡，

18、一般在室温下进行,第四节 HPLC分离条件的选择,第五节 HPLC的建立与应用,一、建立HPLC分析方法的一般步骤,1、根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种HPLC分离方式。,材料来源、浓度范围 组分特性、结构、分子量、溶解性等,一、建立HPLC分析方法的一般步骤,一、建立HPLC分析方法的一般步骤,2、选择合适的分析方法 适用的色谱柱：柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径） 流动相 检测器 样品预处理,一、建立HPLC分析方法的一般步骤,3.分析条件的优化,流动相种类与配比 梯度 温度 流速 检测波长 进样量,一、建立HPLC分析方法的一般步骤,4、由获得的色谱图进行定性

19、分析和定量分析。,二、HPLC定性定量分析方法,1、定性分析,色谱鉴定法：保留时间对照 化学鉴定法：利用专属化学反应对分离 后收集的组分定性 色谱-光谱联用定性 非在线色谱光谱联用法： 色谱光谱联用仪,二、HPLC定性定量分析方法,2、定量分析,外标法：外标工作曲线法、外标一点法、外标二点法等 不需知道校正因子，但需进样量准确 内标法：内标工作曲线法、内标一点法、内标二点法、内标对比法,1、在食品分析中的应用 食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、矿物质等； 食品添加剂分析：甜味剂、防腐剂、着色剂、抗氧化剂等； 食品污染物分析：霉菌毒素、微量元素、多环芳烃等。 2、在环境

20、分析中的应用 多环芳烃、农药（如氨基甲酸脂类）残留等。,三、HPLC的应用,3、在生命科学中的应用 分子水平上研究生命科学、遗传工程、临床化学、分子生物学等必不可少的工具 低分子量物质：氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇、卟啉、糖类、维生素等分离和测定 高分子量物质：多肽、核糖核酸、蛋白质和酶的纯化、分离和测定,三、HPLC的应用,4、在医学检验中的应用 体液中代谢物测定；药代动力学研究；临床药物监测： 合成药物：抗生素、抗忧郁药、黄胺类药等 天然药物：生物碱（吲哚碱、强心甙）等 5、在无机分析中的应用 阳、阴离子的分析等。,三、HPLC的应用,一、含义,电泳：在电场作用下，电解质溶液中的带电质点

21、向电荷相反的电极方向迁移的过程。 毛细管电泳：在毛细管中进行的电泳。,第六节毛细管电泳法,电泳：带电粒子在电场作用下迁移 电渗：溶剂在电场作用下的单向流动,正溶质离子所受的力：电场力 + 电渗力 负溶质离子所受的力：电场力 电渗力 中性分子所受的力：电渗力,二、基本原理,电渗流速度是电泳流速度的5-7倍，混合物中所有的组份随电渗流朝一个方向迁移。 流出顺序：正离子中性粒子负离子,毛细管区带电泳（CZE） 毛细管凝胶电泳（CGE） 胶束电动毛细管色谱（MECC） 毛细管离子分析,三、分类,1、毛细管区带电泳 CZE,带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。 正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出 中性粒子：无电泳，受电渗流影响，在阳离子后流出,最基本、应用广的分离模式,阴离子：两种效应的运动方向相反；电渗流 电泳时,阴离子在负极最后流出,2、毛细管凝胶电泳 CGE,将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。 其具有多孔性，