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1、项目三、淀粉酶的制备及活力测定,任务1、淀粉酶的制备及活力测定的方案的制备,樊贝贝 第二组 生物制药1111 学号：2011423105,目录,知识链接 实训原理 工艺流程 操作要点 活力测定,一、知识链接,1、淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，通常通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料，由于淀粉酶的高效性及专一性，酶退浆的退浆率高，退浆快，污染少，产品比酸法、碱法更柔软，且不损伤纤维。淀粉酶的种类很多，根据织物不同，设备组合不同，工艺流程也不同，目前所用的退浆方法有浸渍法、堆置法、卷染法、连续洗等，由于淀粉酶退浆机械作用小，水的用量少，可以在低温条件下达到退浆效果，具有鲜明的环保特色。,2、淀粉

2、酶 amylase，一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等1，4-葡聚糖，水解1，4-糖苷键的酶。根据酶水解产物异构类型的不同可分为-淀粉酶（EC3211）与-淀粉酶（EC3212）。,-淀粉酶抑制剂,a、-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。微生物的酶几乎都是分泌性的。此酶以Ca2+为必需因子并作为稳定因子和激活因子，也有部分淀粉酶为非Ca2+依赖型。,b、-淀粉酶与-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断1，4-葡聚糖链。主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。,二、实训原理,淀粉酶广泛存在于植物、

3、哺乳动物和微生物中。淀粉酶是内切酶，酶的作用点仅限于淀粉链的1，4糖苷键，对1，6糖苷键不能作用，但能越过1，6糖苷键，将1，4糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应逐渐变红棕色。,在酶解的最初阶段，淀粉酶对淀粉的水解速度很快，但当水解到一定程度后，水解虽在继续进行，水解速度却变得缓慢。该酶的最小作用底物是麦芽三糖以上的低聚糖，对麦芽三糖的作用很弱，对麦芽糖没有水解能力。,枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是当今工业酶制剂的主要生产菌种之一，主要用于生产淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等。,三、工艺流程（固态培养法),斜面活化,摇瓶培养,种子罐扩大培养,厚层

4、通风培养,抽提,过滤,滤液,沉淀,离心,脱水,干燥,成品,烘干,粗酶制品,四、操作要点,1、活化培养基（%）：麦麸 5，豆饼粉3，蛋白胨0.05，琼脂2，溶解过滤后分装试管，0.1MPa蒸汽压力下灭菌20min即可。 2、种子培养基（%）：豆饼1，蛋白胨0.4，酵母膏0.4，氯化钠0.05，溶解后调pH至7.17.2，0.1MPa蒸汽压力下灭菌2030min。,3、麸曲培养基（%）：麸皮70，米糠20，木薯粉或豆饼粉10，烧碱0.5，加水使含量达60左右，常压蒸汽煮1h即可。 4、厚层通风培养：麸曲培养基冷却到38接入0.5%左右的种子，拌匀后在厚层通风培养室内38培养20h出曲风干即得粗品。

5、,.or chat with him,5、精制：麸曲用1%食盐水浸泡3h（用量34倍），然后过滤，收集滤液，调滤液pH至5.56.0，然后加入冷却至10的酒精使最终浓度为70%沉淀酶，沉淀经离心，无水酒精洗涤脱水后，25下烘干或风干，粉碎，加入填充料等即为精制酶制剂。,五、活力测定,酶活力也称酶活性，是以酶在最适温度、最适pH等条件下，催化一定的化学反应的初速度来表示。本实验是以一定量的淀粉酶液，于37C、pH6.8的条件下，在一定的初始作用时间里将淀粉转化为还原糖，然后通过与DNS试剂作用，比色测定，求得还原糖的生成量，从而计算出酶反应的初速度，即酶的活力。这里规定，一个淀粉酶活力单位定义为

6、在37C、pH6.8的条件下，每分钟水解淀粉生成1mg还原糖所需的酶量。,（一）实训原理,-淀粉酶能将淀粉分子链中的-1,4葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应逐渐消失，呈红棕色，其颜色消失的速度与酶活力有关，故可通过固定反应后的吸光度计算其酶活力。,（二）实训试剂及仪器,1、试剂 原碘液 称取碘（I2）11g，碘化钾（KI）22g，用少量水使碘完全溶解，然后定容至500mL，贮于棕色瓶中。 稀碘液 吸取原碘液2.00mL，加碘化钾20g，用水溶解并定容至500mL，贮于棕色瓶中。, 20gL可溶性淀粉溶液 称取可溶性淀粉（以绝干计）2

7、000g精确至0.001g，用水调成浆状物在搅动下缓缓倾入70mL沸水中。然后，以30mL水分几次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，加热至完全透明，冷却，定容至100mL。此溶液需要当天配制。, 磷酸缓冲液（pH6.0） 称取磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）45.23g、柠檬酸（C6H8O7H2O）8.07g，用水溶解并定容至1 000mL。配好后用pH计校正。,2、仪器 分光光度计应符合GB 9721的有关规定 秒表 恒温水浴（600.2） 试管25mm2000mm,1. 待测酶液的制备 称取酶粉l-2g，精确至0.0002g（或吸取液体酶100mL），先用少量的磷酸缓冲液溶解，并用玻璃

8、搅拌棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（将估计酶活力除以4，即酶活力应在3.7-5.6IUmL范围内），摇匀。通过4层纱布过滤，滤液供测定用。,（三）操作方法,2. 测定 （1）吸取可溶性淀粉溶液20.0mL于试管中，加入缓冲液5.00mL，摇匀后，于（600.2）恒温水浴中预热5min。 （2）加入稀释好的待测酶液1.00mL，立刻记时，摇匀，准确反应5min。 （3）立即吸取反应液1.00mL于稀碘液5.00mL中，摇匀，并以稀碘液作空白，于660nm波长下，用10mm比色皿，迅速测定其吸光度（A）。根据其吸光度查表，求得