化学人工酶和生物酶工程.ppt

1、化学人工酶和生物酶工程,第八章,主讲人余子全,第一节 化学人工酶,此外，根据有关酶和辅酶的知识，用有机化学合成的方法设计、合成比辅酶分子更小简单的辅酶模型化合物，研究其在非酶促条件下的反应活性和催化机理。,化学人工酶（Artifical enzyme)：根据酶的催化原理，模拟天然酶的生物催化功能，利用有机化学和生物学的方法合成的具有专一催化功能的酶的模拟物。,一、半合成酶(Semisynthetic enzyme),半合成酶：将具有一定结构和功能的物质与特异的蛋白质结合，形成的一类具有新的生物催化功能的催化剂,半合成酶的合成方法： 1. 将具有催化活性的金属或金属有机物与具有特异性的蛋白质相结

2、合,2. 将具有特异性的物质与具有催化功能的酶相结合,Gray与Margalit将电子传递催化剂Rn钌(NH3)53+，与巨头鲸肌红蛋白结合，产生半合成的无机生物酶。肌红蛋白传递氧气， Rn(NH3)53+能氧化各种有机物(如抗坏血酸)。接近天然的抗坏血酸氧化酶的活力。（与蛋白结合的优势）,美国Schultz小组，寡聚核苷酸链连接到RNA酶的Cys166上。利用寡聚核苷酸链的碱基互补关系，显示出对RNA链特定位点的水解作用。第一个不同于DNA限制性内切酶的RNA限制性内切酶。 Kaiser小组 ，黄素木瓜蛋白酶(FP) 木瓜蛋白酶Cys25的巯基参与蛋白质水解反应。8-溴乙酰黄素与此巯基结合后

3、，丧失水解活性，FP催化效率是黄素（黄素氧化还原酶的辅酶）的 1000倍，达到了天然黄素氧化还原酶的活性。,二、全合成酶,这类人工酶不是蛋白质（抗体酶除外），而是一些有机化合物通过引入酶的催化基团来控制空间构象，像天然酶那样能催化特异性的化学反应。,抗体酶的理论基础 半抗原与催化性抗体 抗体酶的制备方法 抗体酶应用,（一）抗体酶（Abzyme）,是一种新型人工酶制剂，是20世纪80年代以来出现的一种具有催化活性的蛋白质，是利用生物学和化学的成果在分子水平交叉渗透研究的产物，其本质上是免疫球蛋白，只是在其易变区被赋予了酶的属性，是一类具有生物催化功能的抗体分子。又称为催化性抗体（Catalyti

4、c Antibody），以抗原或半抗原（过渡态类似物）制备的，并能催化其反应的抗体。,抗体酶的理论基础,抗原与抗体的结合具有高度专一性，这一性质和酶与底物的结合非常相似,Anti-cancer tumer-targetting abzyme,Pauling(1948)过渡态理论：酶之所以具有催化活性在于其能够结合并稳定反应底物与产物之间的过渡态构型，降低了底物分子的能量障碍.,S,底物转变为过渡态,过渡态类似物合成,酶作为抗原或半抗原,补充知识点： 如果能够模拟合成出酶催化反应过渡态结构的稳定物质，该物质便能与相应的酶紧密结合，并成为酶的抑制剂，这类物质成为酶的过渡态类似物。,酶的过渡态类似物

5、：对酶催化反应过渡态结构的模拟的稳定物质， 能与酶紧密结合，是酶的抑制剂。,酶与抗体的不同点：酶能够结合并稳定化学反应的过渡态，降低反应的活化能（催化）；而抗体结合的抗原只是一个基态分子，没有催化活性。 酶与抗体的共同点：酶分子与它催化反应的过渡态互补，抗体与抗原互补；酶和抗体都是有生物活性的蛋白质。,Lerner(1984)提出：若以过渡态类似物为半抗原，则其诱发产生的抗体应该与该类似物具有互补构象；这种抗体与底物结合后，能够诱导底物进入过渡态结构，从而引起催化作用。,1986年Lerner在Science上发表有关抗体酶研究成果，标志着抗体酶研究进入了一个新阶段。,发展历程,W. P. J

6、encks(1969)认为：酶分子与其催化反应的过渡态在结构和电荷两方面呈互补，即酶分子充当了反应物的模板，使底物分子转变为新的构型；如果抗体能结合过渡态，那么在理论上便能获得催化活性。,优势 1 产生新酶 2 立体专一性 3 催化不利的反应过程 应用 医学 药物 抗病毒 工业 化工 材料,抗体酶的反应类型：碳酸盐水解、脂水解、酰胺水解、Claisen重排、酰胺化、内酯化、转酯、光分解（依赖光）、光二聚化、-消除、顺反异构化、脱羧、金属螯合、亚胺化、氧化等40多种反应。,半抗原：是一类小分子化合物，本身不能诱导免疫应答，只有当共价结合到具有免疫性的蛋白质后，注射动物才能诱导出与半抗原特异性结合

7、的抗体；如果半抗原是酶的过渡态结构类似物，则有可能获得具有催化活性的抗体，也就是抗体酶。,例如：以一羧基酯和酰胺水解为例，根据反应机理，其过渡态应该为一个四面体结构，以具有四面体结构的高能中间类似物为半抗原，均能获得预期的抗体酶；该抗体酶与过渡态类似物具有完全互补的立体结构。,半抗原与催化性抗体,1、半抗原设计中应考虑： (1)产生的抗体能否具有预期的催化活性。 (2)能否刺激机体免疫应答。,2、半抗原结构与催化抗体之间的关系： (1)半抗原结构中应含有芳香结构（具较强的免疫原性）。 (2)催化抗体和半抗原的亲和力。 (3)诱导羧酸酯、酰胺水解的催化性抗体，可利用其具有四面体结构的高能过渡态类

8、似物为抗原。 (4)半抗原设计应考虑催化反应的环境与反应机制，即所设计的半抗原应能诱导催化抗体在其抗原结合部位创造出特定的有利于催化反应的环境。（疏水微环境）,抗体酶的制备方法,拷贝法 修饰法 诱导法,1、拷贝法：用已知的酶为抗原免疫动物，获得抗酶的抗体，再用抗酶的抗体免疫动物并进行单克隆化，即可获得抗抗体，抗抗体实际上就是具有原来酶活性的抗体酶。抗抗体（二抗和抗原一样具有和底物结合的能力）,2、修饰法：借助于基因工程和蛋白质工程技术，将催化基团引入到已有底物结合能力的抗体的抗原结合位点上，或采用分于修饰技术，将抗体抗原结合部位的结构改变成为酶分子的活性中心，从而产生有催化活性的抗体。（寡核苷

9、酸定点诱变技术 ；选择性化学修饰法）,3、诱导法：用事先设计好的抗原(半抗原)按照一般的单克隆制备程序，获得具有催化活性的抗体，即抗体酶。,抗体酶的辅因子,在抗体的抗原结合位点引入辅因子的方法目前有三种： 1、用多种底物类似物一次免疫动物，产生既有辅因子结合部位又有底物结合部位的抗体。 2、用半合成法将辅因子或催化基团引入到抗体底物结合部位。 3、向抗体中的一条链的抗原结合部位引入辅因子.,抗体酶应用,1、切割肽链的抗体酶 2、癌症与病毒性疾病治疗 3、疫苗 4、新催化剂开发 5、药物设计、合成 6、治疗酶缺乏遗传病,抗体酶新进展,组合抗体库的噬菌体表面展示 抗体酶的研究进展 Phage Di

10、splay of Combinatorial Antibody Libraries Recent advances in the generation and selection of antibodies from combinatorial libraries allow for the rapid production of antibodies from immune and non-immune sources.,意义,1、省去了单克隆抗体制备过程中许多费时费力的过程。 2、细胞水平进入分子水平 3、重轻链的随机组合提高了抗体的多样性，人工突变 4、花费时间少（1-2周与数月） 5、

11、适合非细胞工程实验室 6、也可用于抗体的制备,利用各种有机分子(如-环糊精、卟啉等)和金属离子而制备的具有水解、氧化还原、转氨等功能的全合成酶： (1)氨肽酶全合成酶：三乙撑四胺(Trien)的Co 络合物。 (2)转氨全合成酶：Gly甘与Ala丙的西佛氏碱的Cu()络合物。 (3)ATP水解全合成酶：CoEdda(H2O2)2-等。 -Benzyme人工酶能模拟-胰凝乳蛋白酶活性（最成功的） 由环糊精制成的人工转氨酶能催化酮酸与磷酸吡哆胺专一性地合成氨基酸。,（二）小分子有机化合物,水解酶模拟： -胰凝乳蛋白酶是一种蛋白质水解酶，具有包结底物的疏水性环状结合部位，催化部位中含有57-组氨酸咪

12、唑基、102-天冬氨酸羧基及195-丝氨酸羟基，三者共同织成 “电荷中继系统”在催化底物水解时起着关键作用。近年、模拟-胰凝乳蛋白酶等水解酶的研究进展迅速，取得一些重要结果。 如M.L.Bender等设计合成的-Benzyme催化醋酸间叔丁苯酯水解反应比酶催化更快，热稳定性和酸碱稳定性高于天然酶。RBreslow等合成的桥联环糊精与Cu2+的络合物在中性条件下催化一些双疏水部位的水解反应速率比无催化剂时提高1.81042.2105倍。,醛缩酶模拟,二胺（当m=0）、多胺环糊精模拟醛缩酶功能，催化丙酮与对硝基苯甲醛缩合，生成-醇酮 ，反应条件温和，反应选择性好。,桥联环糊精催化羧酸对硝基苯酯的水

13、解,（三）人工聚合物酶 用分子印迹技术制备的人工酶。其原理与抗体酶相同，只是用人工聚合物代替抗体。 以对硝基酚甲基磷酸酯（硝基酚乙酸酯水解反应的过渡态类似物）为模板，得到的有机功能团的聚合物，可以催化硝基酚乙酸酯水解。,1、分子印迹,分子印迹(Molecular Impriting)：一种模拟抗体抗原相互作用的人工生物模板技术， 1972年由德国的Wulff提出。可以针对不同的目的，采用人工合成的方法，构造出具有特定选择性识别位点的模板聚合物，这种聚合物可作为酶，用于生物物质的分析、检测、分离与纯化以及酶的模拟和催化合成等。,化学模拟酶催化剂与天然的生物酶催化剂相比,具有抗恶劣环境的能力,表现

14、出高度的稳定性和长的使用寿命,2、对特定分子(印迹分子或称模板)具有选择性的聚合物过程。 包括： (1)选定特定分子和单体，让它们之间发生互补作用。 (2)在印迹分子一单体聚合物周围发生聚合反应。 (3)用抽提法从聚合物中除去印迹分子。则聚合物中留有恰似印迹分子的空间，可用于高分子高选择性分离材料。 从人工酶角度来看，若用过渡态类似物作为印迹分子，则所得聚合物具有相应的催化活性，此时代替抗体的只是人工聚合物。,3、印迹聚合物的制备及特性,3.1 制备 印迹高聚物的形成需要基质单体、官能团单体和印迹分子三者的相互作用,其制备方法主要有两种:由等人创立和发展起来的共价键法(预组装)和由等人发展起来

15、的非共价键法 (自组装）,共价键法,印迹分子与官能团单体以共价键形式结合而形成印迹分子的衍生物,该衍生物在交联剂的存在下接枝到聚合物的基质上。在印迹聚合物形成后,再将与印迹分子连接的这些共价键打断,并将印迹分子洗脱出来,从而形成具有吸附活性的印迹聚合物.在共价键法中,所采用的单体通常为低分子化合物,在选择时应考虑该单体与印迹分子形成的共价键键能要适当,达到在聚合时能牢固结合,在聚合后又能完全脱除的目的,非共价键法,把适当比例的印迹分子与官能团单体和交联剂混合,通过非共价键结合在一起制成非共价键印迹分子聚合物。这些非共价键包括离子键、氢键、疏水与静电作用等。由于这种方法与溶剂的极性密切有关,所以

16、印迹高聚物的形成是在有机溶剂中完成的,3.2 特性,在分子印迹技术中所用的聚合物必须具有特定的物理及化学性质,并对一些物理化学作用具有一定抵抗能力。,4 应用实例,4.2药物分析 基于针对不同印迹分子可设计合成出不同的印迹高聚物这一点,等在1993年提出了一种新的放射性标记配体结合分析方法()测定人体血清中的药物。,4.3药物控制释放 印迹高聚物可以吸收大量与印迹分子结构相似的物质,可以被用来做为一种反应性控制释放载体（竞争抑制）。,4.1手性异构体拆分 将印迹聚合物作为高效液相色谱的固定相用于分离多肽,蛋白质,核糖核蛋白及各种糖类分子。,第二节 生物酶工程,生物酶工程是酶学和以DNA重组技术

17、为主的现代分子生物学技术相结合的一门新兴的生物工程，亦称高级酶工程(Advanced Enzyme Engineering),一、克隆酶 1.克隆酶：通过基因工程手段，人们能偶克隆各种天然蛋白质和酶基因，并将其与适当的调节信号相连接，再通过一定得载体（质粒）导入能够大量繁殖的微生物细胞内，使之高效表达。 2. 意义：医药用酶 3. 技术步骤： 目的基因获得 选择载体 重组DNA连接 重组基因转化 克隆酶基因表达,二、突变酶 1.突变酶：利用有控制的对天然酶基因进行剪切、修饰或突变，从而改变酶的催化特性、底物专一性或辅酶专一性，从而更能满足人们的需要 其主要内容：酶选择性修饰以及对酶基因进行定点

18、突变 2. 定点突变方法： 盒式诱变(Cassette Mutaganesis) 寡聚核苷酸引物诱变 PCR诱变,3. 遗传修饰改变酶的性能大致有： 提高酶稳定性 提高酶活性 改变底物专一性 改变酶的最适pH值 改变酶对辅酶的要求 改变酶的别够调节能力,三、超自然的优质酶新酶 人为地有目的地设计酶基因，导入适当宿主细胞中加以表达，生产超自然的优质酶 此过程的关键是对酶分子各个结构层次上的设计与组合,四氢呋喃,四氢吡喃,环氧化物,放射性标记配体结合分析方法（RIA） *Ag; Ag ;*Ag-Ab; Ag-Ab 前提：*Ag和Ab为恒量，Ag和*Ag的总量大于Ab上的有效结合位点时，*Ag、Ag、Ab三者混合后: *Ag-Ab的形成量与Ag量成反比，剩下的未结合或游离的*Ag则与Ag量成正比，因此测定*AgAb或*Ag即可推算出被测的Ag量 这种现象称为竞争结合反应，这种*AgAb的量（因变量）与Ag的量(自变量）之间存在的竞争性抑制的数量关系是RIA的定量基础。这种数量关系可以由标准竞争抑制曲线(简称标准曲线)来显示。,放射免疫分析的基本原理 *Ag代表标记抗原(Labeled Antigen)，Ag代表非标记抗原，Ab代表特异抗体