蛋白检测ELISA.ppt

1、蛋白质检测-ELISA，1.ELISA的原理2.ELISA的类型3 .试剂准备：免疫吸附剂结合酶催化剂基质的准备4 .对照设定5 .标本的采集和保存6 .结果显示，酶催化剂免疫吸附elisa(enzymelinkedimmunna基础：抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶催化剂， 加入酶促反应的基质后，基质被酶催化剂催化为有色生成物，生成物的量与标本中的被测物质的量直接相关，从而进行定性或量化分析。 1.ELISA的原理、和酶催化剂免疫吸附剂测定的基本原理是将抗原或抗体结合在某个固相载体表面上，保持其免疫活性。 将抗原或抗体与某个酶催化剂结合形成酶催化剂标识牌抗原或抗体，该酶催化剂标识牌抗原或抗

2、体同时保持其免疫活性和酶活性。 测定时，使被检体(测定其中的抗体或抗原)和酶催化剂标识牌抗原或抗体以不同的顺序与固相载体表面的抗原或抗体反应。 用洗涤的方法将固相载体上形成的抗原抗体复合体从其他物质中分离出来，最后结合到固相载体上的酶催化剂量与样品中的被测物质的量成正比。 加入酶促反应基质后，基质被酶催化剂催化变成有色产物，产物的量与标本中被测物质的量直接相关，因此可根据颜色反应的浓淡刊物进行定性或定量分析。 1.1抗原抗体反应，1.1.1可逆性，抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为Ag AbAgAb，抗体的亲和力(affinity )，平衡常数k可以表示： K=A

3、gAbAgAb高亲和力抗体的抗原结合点和抗原决定克拉星空卫视非常适合空间构型解离的抗原和抗体可以保持原来的结构和活性。 1.1.2专一性、抗原抗体的结合发生在抗原决定簇星空卫视与抗体的结合位点之间。 化学结构与空间构型有互补关系，具有较高的专一性。 不分离被检物，测定某种特定的物质。 1.1.3最佳比例，1.1.4易感性，化学比色法灵敏度在mg/ml水平酶促反应测定法的灵敏度在约5-10g/ml免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的灵敏度比酶促反应法近标识牌的免疫灵敏度高数千倍，达到ng/ml水平的1.4免疫测定在病虫害检测中的应用涉及到各种抗原成分(如包括细小病毒外壳蛋白、细菌细胞贴壁蛋白成分和鞭毛

4、等)、小分子半抗原(包括植物荷尔蒙、化学农药等)均可制备特异性抗血清或单克隆抗体，以此抗体为试剂检查标本中的对应抗原，因此免疫测定的应用范围极广。 2ELISA的类型，ELISA可以用于抗原的测定，也可以用于抗体的测定。 (1)固相抗原或抗体，即免疫吸附剂(immunosorbent )； (2)酶催化剂标识牌抗原或抗体。 (3)酶促反应的基质，被称为结合物(conjugate )。 可以设定修订各种类型的检查方法。 2.2.1二抗体穿山鼠开关法抗原测定，该方法适用于检测各种蛋白质等大分子抗原，只要得到对被检抗原的特异性抗体，就可用于固相载体的包复和酶催化剂结合物的制备。 (1)将特异性抗体与

5、固相载体连接形成固相抗体：洗净除去未结合的抗体及杂质。 (2)加检标本：与固相抗体发生接触反应，使标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。 清洗除去其他未结合物质。 (3)酶催化剂标识牌抗体：使固相免疫复合物上的抗原和酶催化剂标识牌抗体结合。 完全清洗未结合的酶催化剂标识牌抗体。 此时固相载体上的酶催化剂量与标本中被测物质的量呈正相关。 (4)基质添加：穿山鼠开关式复合体中的酶催化基质变为有色生成物。 根据颜色反应的程度对该抗原进行定性或定量。根据同样的原理，可以将大分子抗原分别调制成固相抗原和酶催化剂标识牌抗原结合物，用二抗原穿山鼠开关法测定标本中的抗体。 2.2.2间接法测

6、定抗体，诊断传染病。 间接法的优点是，只需转换包裹抗原，就可以建立使用同一酶催化剂标识牌抗抗体检测对应抗体的方法。 操作步骤1 )将特异性抗原与固相载体连接形成固相抗原：洗净除去未结合的抗原及杂质。 2 )加稀释的待检血清：其中特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。 3 )酶催化剂标识牌的抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，使该抗体间接地标识牌酶催化剂。 洗涤后，固相载体上的酶催化剂量表示特异性抗体的量。 4 )加入基质发色：色深度表示标本中被检抗体的量。2.2.3竞争法测定抗体或抗原，抗原材料中的干扰物质难以除去时，或者难以得到一盏茶的精制抗原时，可以用这种方法检测特异性抗体。2.2.3

7、竞争法测定抗原，小分子抗原或半抗原由于缺乏两个以上可以穿山鼠开关法的部位，不能用双抗体穿山鼠开关法测定，可以采用竞争法模式。 其原理是标本中抗原和一定量的酶催化剂标识牌抗原网络冲突并与固相抗体结合。 标本中抗原含量越多，与固相结合的酶催化剂标识牌抗原越少，最后的显色也越浅。 小分子荷尔蒙激素、药物等的ELISA测定中多采用这种方法。 3. ELISA的试剂(a、b、c三部分)，ELISA有免疫吸附剂、结合物、酶催化剂基质三种必要的试剂。 (1)包复抗原或抗体的固相载体(免疫吸附剂) (2)酶催化剂标识牌抗原或抗体(结合物) (3)酶催化剂的基质(4)阴性对照品和阳性对照品，参考标准品(5)结合

8、物及标本的稀释液(6)清扫液(7)酶反应终止液，ELISA试剂准备a，固相载体聚苯乙烯聚氯乙烯。 聚氯乙烯比聚丙乙烯对蛋白质的吸附性能高，但空白对照值也稍高。 良好的ELISA大板块吸附性能好，空白对照值低，孔底透明度高，各大板块间、同一大板块各孔间、同一大板块各孔间的性能应相近。 3.1.2将包裹的方式、抗原或抗体固定在过程中称为包裹(coating )。 蛋白质和聚丙乙烯固相载体通过非极性吸附结合，依赖于蛋白质分子结构上的疏水化学基与固相载体表面的疏水化学基之间的作用。 该非极性吸附是非特异性的，受蛋白质分子量、等电点、浓度等的影响。 大分子蛋白质小的分子蛋白质通常含有更多的疏水化学基，因

9、此容易吸附于固相载体表面。 难以吸附的非蛋白质抗原由于被间接包复的抗原经过固相抗体的亲和色谱法作用，被固相包复的抗原的纯度大幅提高，因此含有较多杂质的抗原也可以采用捕获包复法。 亲和素生物学立即用亲和素包裹载体，加入生物素化的DNA的方法均匀牢固，广泛应用于各种抗原物质的定量。 脂质不能与固相载体结合，在有机溶剂(如乙醇)中溶解后，放入ELISA板孔中，打开冰箱一夜或用冷风吹走，酒精挥发后，脂质可以自然干燥在固相表面。 优点：考试专一性、敏感性均有改善，重现性好。 抗原的用量很少，直接包含的1/10至/100。 包裹用抗原：天然抗原、重组抗原及合成多肽抗原3种。 合成多肽抗原是抗原决定级星空卫

10、视的氨基酸排列顺序被合成到人造的中的多肽片段。 一般仅含有一个抗原决定克拉星空卫视，纯度高，专一性也高，但由于分子量太小，所以经常难以直接吸附在固相上。 通过耦合和固相载体的吸附间接地与固相载体表面结合。 3.1.4包裹用抗体，IgG对聚丙乙烯有很强的吸附力，其连接在Fc段发生，抗体结合点向外部露出。提取抗血清或含有单克隆抗体的培养液，除去杂抗体后用于ELISA，保证试验的专一性。 3.1.5包括的条件、pH9.6碳酸盐缓冲液pH7.2的磷酸盐缓冲液pH7-8的Tris-HCL缓冲液。 放入包装液后，在4-8冰箱中放置一晚，用37保温2小时。 包裹浓度可以根据载体和包裹物的性质有很大变化，各批

11、材料需要通过实验与酶催化剂结合物的浓度协调选择。 一般的蛋白质包裹浓度是10ng/ml-20ug/ml。 3.1.6封闭、封闭(blocking )是继包裹后用高浓度无关蛋白质溶液再包裹的过程。 所谓封闭，就是将许多无关的蛋白质填充到这些个的空隙中，在ELISA后的工序中排除干扰物质的再吸附。 常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA； 10%的小牛血清或1%的动物胶脱脂奶粉，比较廉价，可以高浓度使用(5% )。 在3.4清扫液板式ELISA中，通常的稀释液是含有0.05%吐温20磷酸盐的缓冲液。 ELISA的试剂准备b、3.2结合物，即酶催化剂标识牌抗体(或抗原)是否含有或至少ELISA的重

12、要试剂1酶催化剂的催化活性2抗体(或抗原)的免疫活性3游离的抗体(或抗原) 4结合物，需要良好的稳定性。 3.2.1结合物用抗原与抗体、结合物的制备中使用的纯度高的IgG，在与酶催化剂结合时防止其他的杂质蛋白质干扰作用。 用色谱分析法纯化的抗体，其所有酶催化剂结合物都具有特异性免疫活性，能以较高的稀释度反应，实验结果背景较浅。 ELISA中用酶催化剂标识牌抗原的模式很少，综合要求抗原必须为高纯度。 3.2.2酶催化剂，纯度高，催化反应转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不高，受检体中不存在相同的酶催化剂。 酶催化剂键合物保持活性部分和催化能力，基质的制备和保存容易，价格便宜，有色生成物

13、的测定容易等。 在ELISA中，有HRP (西洋山葵过氧化酶)、AP (碱性磷酸酯酶)、葡萄糖氧化酶、-d半乳糖苷酶、乌土卫五酶等。 3.2.3结合物的制备、酶催化剂标识牌抗体的制备方法主要有戊二醇交联法和过碘酸盐酸法两种。 (1)戊二醛交联法：戊二醛为双功能团试剂，可使酶催化剂与蛋白质的氨基化学基结合. 有效(结合率60%-70% )和重现性好。 交联反应是随机的，结合物的大小也不均匀，在酶催化剂和酶催化剂、抗体和抗体之间也发生交联，可能影响效果。 (2)过碘酸氧化法：应用糖度高的酶催化剂。 高碘酸钠将HRP分子表面的粗多糖氧化成醛化学基很活跃，与蛋白质上的氨基化学基形成chiff盐化学基并

14、结合。 简便有效，3.2.4结合物的保存、酶催化剂和抗体均为生物活性物质，易失活。 高浓度比较稳定，冷冻干燥后可以在通常的冰箱中保存1年左右。 在结合物溶液中加入等体积的甘油，加入蛋白保护剂。 另外，还可以加入抗生素(如庆大霉素)和防腐剂(HRP结合物硫化柳泵、AP结合物硫化氮纳米金属钍)。 试剂备有c酶催化剂基质、3.3酶催化剂基质、3.3.1 HRP基质，OPD氧化后产物呈橙色，酸终止酶促反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的基质。 e、TMB在HRP作用下共产物呈蓝色。 TMB性质比较稳定，可配溶液试剂，只需与H2O2溶液混合即可成为应用液。 酶促

15、反应结束后，TMB产物由蓝色呈黄色，经比色校正可定量，最佳吸收波长为450nm。 ABTS虽然不像OPD和TMB那样敏感，但空白值极低，一部分试剂盒也采用。 AP的底质为磷酸史黛拉酶，采用对硝基苯基磷酸酯类化合物作为底质。 生成物是黄色的对硝基酚，在405nm的波长处有吸收峰。 用NaOH停止酶促反应时，黄色有会儿稳定。 AP中也有发光基质(磷酸4甲基酮)，可以将ELISA用于荧光测量，灵敏度比使用显色基质的比色法高。 3.5酶促反应终止液常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度因添加量和比色液的最终体积而异，板式ELISA一般采用2mol/L。4对照设定中，阳性对照品和阴性对照品为检验试验有效性

16、的联合特罗尔品，同时作为判定结果的对照。 阳性对照品的基本组成尽可能与检测标本的组成一致，多以含有蛋白保护剂的缓冲液为基质。 添加的量必须是与试剂的灵敏度相符的量，比较在测定中得到的吸光值和被检体的吸光值，可以估计被检体物质的量。 以标准品为参考，定量测定制作定标曲线的参考标准品，一般配合含有蛋白保护剂和防腐剂的缓冲液，包括复盖可检测范围的4-5个浓度。 反应的温度和时间仍然是影响显色的主要因素。 在一定时间内阴性孔可以保持无色，阳性孔随时延长颜色增强。 适当提高温度有助于加快发色的进行。 TMB不受光的影响，可以在室温放置于工作平台的同时使观察结果发生反应。 但是，为了保证实验结果的稳定性，

17、最好以规定的适当的时间节点读取结果。 TMB在HRP作用后，约40分钟显色达到峰值，逐渐变弱，到2小时后完全无色消失。比色、擦掉附着在板底的液体后，将板正确装入酶催化剂标准比色补正。 用蒸馏水零点测定基质孔(无任何反应只加入基质液的孔)和空白孔(代替标本以生理盐溶液或稀释液为全过程的孔)，记录了本次试剂的状况。 然后在空白对照孔中蒸馏水可以校准零点，这些个各孔的吸光率需要扣除空白对照孔的吸光率进行校准。 结果为光密度(oplical density，OD )，目前为规定的吸光率(absorbence，a )，两者意义相同。 通常的显示方法是，将吸收波长写在a字母的右下角，例如OPD的吸收波长是

18、492nm，显示方法是A492nm或OD492nm。酶催化剂标准色校正、酶催化剂标准色校正简称酶催化剂标准器，通常指测定ELISA光度校正。 根据固相载体的形式，分别有特殊的大板块、珠子、适合小试管的设定修订。 酶催化剂标记的主要性能指标有测定速度、读取值的精准性、重复性、精度和可测定范围、线性等。 优秀的酶催化剂标记读数一般精确到0.001，精准性达1%，重现性达0.5%。 操作时室温宜为1530，使用前将机器预热1530分钟，测定结果更稳定。 在测定a值时，选择生成物的敏感吸收峰，例如OPD用492nm波长。 有些酶催化剂标记可以用双波长式阅读。 性能因酶催化剂标记而异，使用中请详细阅读说明书。 5结果判断、5.1定性测定、定性测定的结果判断为“有”或“无”的回答，分别用“阳性”、“阴性”表示。 在该半定量测定中，将标本连续稀释进行试验，显示呈阳性的最高稀释度为滴度。 从滴度的高低可以判断标本反应性的强弱，观察不稀释的标本的显色浓淡判断为强阳性、弱阳性具有更定量的意义。 在间接法和穿山鼠开关法的ELSIA中，阳性孔的颜色深度比阴性孔的颜色深度深。 竞争法ELISA中相反，阴性孔的颜色深度比阳性孔深。 两种反应结果的判断方法不同，分为以下几种。 a .阳性判定值： (