GB-T15356-1994 化学试剂 核苷酸测定通则

中华人民共和国国家标准

GB/T15356一94

剂贝

通

试定

观

学酸

普

化。

核

Chemicalreagent

Generalrulesforthedeterminationofnucleotides

1主题内容与适用范围

本标准规定了化学试剂核昔酸含量、熔点、比旋光度、层析试验和干燥失重测定的通用方法。

本标准适用于化学试剂核昔酸及其衍生物的分析。

本标准不适用于药用核昔酸及其衍生物的分析。

2弓}用标准

GB/T601化学试剂滴定分析(容量分析)用标准溶液的制备

GB/T602化学试剂杂质测定用标准溶液的制备

GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备

GB/"I'613化学试剂比旋光度测定通用方法

GB/T617化学试剂熔点范围测定通用方法

GB/T6”化学试剂采样及验收规则

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T9008液相色谱法术语柱液相色谱法和平面色谱法

GB/T9721化学试剂分子吸收分光光度法通则(紫外和可见部分)

3一般规定

3.1本标准中所用的水、在没有注明其他要求时，应符合GB/T6682中三级水的规格。

3.2本标准中所用试剂的纯度应为分析纯。

3.3本标准中凡层析测定时，核普酸R，值均应以在完全相同条件下的对照样品的R，值为判断标准，

且每次测定都不得省去作为判断标准的对照样品。

3.4本标准中凡层析测定需作杂质限量检测时，应使用符合6.1.2.1条之规定的对照样品。

熔点测定

按GB/T617规定测定。

核昔酸的熔点数值可参考附录A(参考件)。

比旋光度的测定

按GB/T613之规定测定。

核昔酸的比旋光度数值可参考附录A(参考件)。

国家技术监督局1994一12一22批准1995一10一01实施

GB/T15356一94

6层析试验

层析试验用于检测核昔酸的纯度及定性鉴别。所有核昔酸均应以下列方法中选择一种方法进行测

定。

6.，纸层析

6.1.1方法原理

纸层析法是以a纸为惰性支持物的一种层析法。分离原理属分配层析的范畴，它利用不同溶质在静

止的水相，亦即纸上所吸附的水为固定相和沿纸流动的有机相(即流动相)两相溶剂的不断分配而达分

离的目的。核昔酸经层析后，常用比移值(凡)来表示各组分在层析谱中的位置。(凡)值按式(1)计算:

·····，.⋯⋯.”.”.“，”。。”..⋯(1)

式中:R,—比移值;

d.-溶质迁移距离,cm;

dm—流动相迁移距离，cm.

在一定的条件下，同一核普酸的R。值是一定的。但由于影响R，值的因素较多，一般都采用与对照

样品对比，即根据样品与对照样品在层析谱中R，值来进行鉴别，并可在254nm的紫外灯下观察，以显

示出杂质斑点的多少和色量来确定样品的纯度。也可剪下斑点，溶于特定溶剂，用紫外分光光度计测定

吸光度，并计算样品的含量和杂质的含量。

6.1.2试剂及材料

6.1.2.1对照样品

纸层析和薄层层析所用的对照样品，主体含量不少于98.0%.

6.1-2.2层析用纸

层析用纸是指具有一定强度、质地均匀平整的纯棉浆制成的撼纸。纸的裁切方向应使流动相能顺着

纹理方向移动。.定性用的层析诊纸灰分须小于0.1%，一般可选用新华一号层析滤纸。

6.，.2.3展开剂

展开剂可参照附录B(参考件)之规定，使用前制备.

必要时可选用其他展开剂。

6.1.2.4展开室

可选用大小适宜的标本缸。

6.，.3操作步骤

取新华一号层析滤纸，长30cm，离底边2cm处用铅笔划一条直线，在直线两端2cm处开始点样，

点与点之间距离为2cm，点样扩散的直径不超过0.5cm.同一张层析纸上可点数个样品，纸的宽度取决

于样品的数目，井留有点对照样品的位置。

称取。.005g核昔酸样品，精确至0.0001g,溶于0.5mL水或盐酸溶液Cc(HCl)=0.01mol/L),

必要时稍微加热溶解。用微量进样器或徽量吸管点样，每次点样后须用冷风吹干，点样量按检测要求不

少于5uL，即相当于50fag样品。

核昔酸纸层析一般采用上行。将已吹干后的层析纸两边卷成图筒状，用二根塑料丝上下固定。在一

高为36cm的标本缸内平放一培养皿，内盛高度为。.5cm的展开剂，将层析纸置于缸内以展开剂的饱

和蒸气平衡2^-4h后，将样品端朝下放入培养皿中，盖紧玻璃盖。展开1216h,流动相前沿即可上升

2628cm,此时将层析纸取出晾干或在50℃干燥。

6.1.4观察吸收斑点

GB/T15356一94

将除去展开剂后的层析纸，在254ran的紫外灯下观察，即观察出紫外吸收斑点。

6.，.5结果的确定

6.1.5.1以50pg点样量，按规定展开并在紫外灯下观察，只观察出一个紫外吸收斑点，且与对照样品

的R，值一致，即可确定其层析试验为合格。

6.1.5.2以50lag点样量，按规定展开并在紫外灯下观察，除显示出一个斑点外，其他核昔酸的斑点小

于或等于按产品规格制备的杂质标准的斑点时，即可确定含其他核昔酸小于或等于标准。

6.2薄层层析

6.2.，方法原理

薄层层析是一种将吸附剂均匀地铺在一块玻璃板上形成一薄层，在此薄层上进行色层分离的一种

层析法，按分离机理可以分为吸附、分配、离子交换、凝胶过瘾等法。本标准主要使用吸附薄层层析法。

6.2.2试剂及材料

6.2.2.1对照样品

应符合6.1.2.1条之规定。

6.2.2.2硅胶GF

本品系白色均匀细粉及萤光粉，粒度平均在10^40jAm之间，含有约13%的半水合硫酸钙。本品应

附合下列分离要求:各取。.040g二甲基黄、苏丹.、靛酚蓝，溶于100mL苯中。取2WL，点样于按

6.2.3.1条之规定制备的硅胶GF板上，用苯展开10cm，色谱图应显示三个清晰的分离斑点，靛酚蓝斑

点接近于起始点，二甲基黄在色谱图的中央，苏丹，介于二者之间。

6.2-2.3展开剂

通常选用正丁醇+丙酮+冰乙酸+500氨水+水=7+5+3十3+2(体积比)。必要时可选用其他展

开剂。可参照附录B(参考件)或其他文献。

6.2.3操作步骤

6.2.3.1制板

制备薄层板所用的玻璃板必需表面光滑，清洁，其大小可根据需要选择。小的可用载玻片，大的可裁

成20cmX20cm的玻璃片。

取一定量的吸附剂(硅胶GF可按25^30g加60^65mL水)在研钵中加水调成糊状，按玻璃板的

尺寸取一定量的吸附剂糊均匀地铺成一厚度为。.2-0.3mm的薄层。若使用涂铺器可按制造厂商推荐

的方法涂铺。铺成的薄层须置于水平台上室温干燥过夜。硅胶GF制板的时间从调成糊状到铺板不应超

过1.5min,

市售的预制板经6.2.2.2条试验，符合分离要求的，亦可使用。

6.2-3.2点样和展层

取薄层板一块，距底边1.5cm处为基线点样，点与点之间的距离为1.5cm，点样扩散的直径不超

过。.2cm，点与点之间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。

称取0.004g核昔酸样品，精确至0.0001g,溶于0.2mL水或盐酸溶液〔c(HCI)二0.01mol/L),

必要时稍微加热溶解，用微量进样器或微量吸管点样，如要多次点样时，可用冷风将前一次点样吹干后，

再点下一次样，点样量按检测要求不少于2KL，即相当于20yg样品，点样时必须注意勿损伤薄层表面。

薄层层析可选用大小适宜的标本缸，将已点样的薄层板平衡后，将样品端朝下放人培养皿中，薄层

板浸人展开剂的深度不超过0.5cm，上行至流动相前沿离顶端。.5-1.0cm处(展开距离一般在15-

20cm)取出晾干，在50℃干燥除去溶剂。

6.2.4观察吸收斑点

应符合6.1.4条之规定。

6.2.5结果的确定

应符合6.1.5.1及6.1.5.2条之规定。

GB/T15356一94

7含里的测定

按GB/T9721之规定，其中:

了.1测定条件

波长:用样品所需的最大吸收波长;

吸收池厚度:1cm;

参比溶液:水或盐酸溶液〔c(HC1)=0.1mol/L〕或盐酸溶液〔c(HCI)=0.01mol/LJ.

72测定方法

称取10mg样品，精确至。.00001g，用盐酸标准溶液〔c(HCI)=0.1mol/L〕或盐酸标准溶液〔。

(HCI)二。.01mol/L)溶解，转移至1。。。mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀。按测定条件7.1条之规定，

测定吸光度。

7.3

式中

结果的计算

核昔酸的含量按式(2)计算:

Ale.M·1000

bxC

X100

二‘二，.”，·····⋯⋯(2)

x—核昔酸的质量百分含量，YD;

A—核普酸样品在最大吸收波长处的吸光度;

。—核普酸样品的摩尔吸收系数，L/cm"mot,

M—核昔酸样品的相对分子质量;

b—吸收池厚度,cm;

C-溶液浓度，mg/L;

1。。。—换算系数。

8千操失重

称取。.1g样品，精确至0.0001gp置于已在10512℃干燥至恒重的称量瓶中.于105士2℃的电烘

箱中干燥至恒重。

干燥失重按式((3)计算:

x=m,-m2X100

叨1

·，，··⋯⋯“.·..······⋯⋯(3)

式中:x—干燥失重，%;

I'-恒重前样品的质量，9;

M,—恒重后样品的质量，9。

GB/T15356一94

附录A

部分核昔酸的比旋光度、熔点和率尔吸收系数

(参考件)

表A1

中文名称

英文名称

(缩写)

相对

分子质量

熔点，'C(,1

比旋光度

Ca7o

摩尔吸收系数,LA.·mol

pHA.-,n.pm..X10'

腺嗦岭核普一5忆碑酸(5'-

腺普酸)

adenosine-5'-

monophosphate

(5'-AMP)

347.22196-200

一460~一480

C=5,INNaOH

225715.1

鸟颐岭核昔-5'-磷酸(5'-

鸟昔酸)

guanosine-5'-

monophosphate

(5'-GMP)

363.24190-200d125612.2

胞啥呢核昔-5‘一磷酸(5'-

胞昔酸)

cytidine-5'-

monophosphate

(5'-CMP)

323.20233d

+27.10

C=O.5,HpO

228013.2

尿啥PA核昔一5‘一碑酸(5，-

尿昔酸)

uridine-5'-

monophosphate

(5'-UMP)

324.19198.5226210.0

腺嗦岭核普-5，一二磷酸

(5‘一腺昔二磷酸)

adenosine-5'-

diphosphate(5'-

ADP)

427.212

25715.0

腺嗦吟核昔一5‘一三磷酸

(5‘一腺昔三碑酸)

adenosine-5'-

triphosphate(5'-

ATP)

507.192257

14.7

腺嗦吟脱氧核昔-5‘一磷酸

(5，一腺嗦吟脱氧核昔酸)

adeninedeoxyri-

bose-5'-phos-

phate(5'-dAMP)

331.22

-38.00

C=O.2,H,0

225814.8

鸟嗦吟脱氧核昔-5，一礴酸

(5，一鸟颐岭脱氧核昔酸)

guaninedeoxyri-

bose-5'-phos-

phate(5'-dGMP)

347.23

一31.0'

C=0.4,H,O

1255

11.8

胞啥9T脱氧核普一5‘一磷酸

(5，一胞哈陡脱筑核昔酸)

cytosinedeoxyri-

bose-5'-phos-

phate(5'-dCMP)

307.20183^-184

+38.60

C=1.2,H,O

1.527913.0

胸腺啥Q脱氧核昔一‘一碑

酸(5‘一胸腺啥咤脱氧核普

酸)

thymidine-5'-

phosphate(5'-

dTMP)

322.21175

一4.40

C=4.H,O

7

2679.6

鸟嗦吟核昔一5，一二磷酸

(5‘一鸟昔二磷酸)

guanosine-5'-

diphosphate(5'-

GDP)

443.21

1

25612.3

2R0

GB/T15356一94

续表A1

摩尔吸收系数,L/cm·mol

中文名称

英文名称

(缩写)

相对

分子质量

熔点.℃‘”

比旋光度

[a习D

PHIA...,nmIft..X10'

12.4

12.8

256-280

鸟嗦吟核普-5'-三磷酸

(5‘一鸟普三确酸)

523.19

胞啥咤核昔一5，一二碑酸

(5‘一胞昔二磷酸)

403.18

胞哈陡核昔一5，一三碑酸

(5‘一胞普三磷酸)

483.1628012.8

262.-、一256

尿心陡核昔-5，一二磷酸

(5‘一尿昔二碑酸)

404.1710.0

尿啼吮核昔-5'一三磷酸

(5，一尿普三碑酸)

484.1510.0

腺嗦吟核昔-3