实用HPLC方法的建立

1、建立实用的HPLC方法，华东理工大学分析测试中心舒措欧2003.03.30，目录，1前言2 HPLC方法构建阶段2.1了解样品情况2.2明确分析目的2.3样品字典处理和测试2.4 HPLC分析模式选择2.5颜色频谱条件2.6方法最优化颜色频谱现象的分析和处理2.7定性和定量方法的建立和论证， 选择三色频谱条件选择3.1流动相选择3.2探测器的选择3.3样本的溶解和预处理3.4样本的样本3.5色频谱柱的选择和保护以及再生3.6泵的选择3.7色频谱电脑工作站4分析方法设置的示例4.1度分析4.2梯度方法的4.3色频谱柱和pH的影响； 5色谱分析中各种地图现象的判断5.1基线噪声的产生和处理5.2基

2、线漂移(上漂移和下漂移)5.3逆峰的产生和消除5.4逆峰的产生和消除5.5峰的前进和后退判断5.6前端峰和尾峰的判断5.7色谱峰的判断5.8色谱峰的脂肪判断和处理，1前言，作为色谱技术的发展和技术的重要分支。 HPLC实验技术是实验性的、强大的操作技术，现行的各种书籍并不涵盖所有知识，实践经验非常重要。HPLC技术是综合性技术，日积月累，厚、薄，不是一天的功劳。跑得快，分分，2 HPLC方法设定的阶段，2.1需要了解样品的情况，首先对样品充分了解，明确分析目的(同一样品，不同的测试要求，其方法也可能不一致)。范例的重要性质包括：所含化合物的数量；化学结构(官能团)；分子量；PKa值；UV频谱；

3、样品中测定成分的浓度范围；样品的溶解度、沸点和稳定性；可能的干扰物质和样品的复杂性等。1大分子、小分子、生物分子等一般HPLC分析分子量在2000以下，大分子一般采用凝胶颜色频谱，生物大分子采用不可变性的色谱体系。2样品是混合物、天然物质或基本上是单一物质。如果是天然物质，一般分离完全采用梯度体系。混合物中是否有结构相似的异构体，组分是复杂的还是使用梯度的，是系列反应的产物。3主要成分，少量成分或微量成分的测定。主要含量的测定一般比较容易。但是少量必须考虑到完全分离的问题。微量成分应考虑检测器的类型、某种提取方法、检测的灵敏度等。4分离化合物是极性、弱极性、非极性或离子化合物、两性化合物。非极

4、性化合物的正常体系较多，如果溶于反相体系的溶剂，则可采用反相体系。药极性，极性化合物反向使用比较方便，可以在流动上添加改性剂，以调节适当的pH。离子化合物可以使用反相控制ph。或者添加离子对试剂。离子交换也可以。在两性化合物中，水溶性差异可以使用反相。但是，如果逆相出峰快，就考虑离子交换。导出后的测量也可以考虑。极性糖类可以使用NH2柱，有条件地使用聚合物的糖柱。多糖要使用凝胶系统。大分子的极性化合物，离子化合物经常使用特定的频谱柱，大部分是聚合物柱。手性化合物应使用手性流动性或手性柱。5样品的溶解度，沸点样品在其他溶剂中的溶解度，对颜色频谱条件的选择至关重要，测定其溶解性能，就可以判断该化合

5、物可能的类型。非极性样品不溶于水，但溶于有机溶剂。如果只能溶于非极性溶剂，一般最好做正常。溶于极性溶剂，以逆相为上策。极性和离子化合物通常溶于水，但根据pH的不同，差异可能很大。极性化合物在水和极性溶剂中都有一定的溶解。在溶解度中，可以判断采用什么体系比较好。挥发性低沸物在ELSD中很难检测到。有特例。6样品的稳定性样品中有水解、光解、醇解、氧化、分解的话，测量时要注意。对光敏感的物质不适合褐色病，避光保存，保管，一起。选择容易水解的物质，适当的溶剂。有些样品可能有酒精分解，流动相不能使用甲醇，必须使用乙腈。容易氧化的物质在溶解时可以加入抗氧剂来调节pH(如PAP测定)。胺化合物。产品不稳定的

6、化合物分析得越快越好。7化合物的化学结构(官能团)中常见的基本结构是苯环、杂环、多环芳烃。气团包括COOH、OH、NH2、SO3H、Cl(Br)、CHO、CO、CH3、C2H5、N=NH、SO、SO2、-O-等。亲水性的气团在半上出峰时间前进，疏水的气团在出峰后移动。从存在的结构中可以判断在溶剂中的溶解度。8化合物的pK值知道pK值，尤其有助于流动相pH的选择。PK的区别是官能团制造的。9 UV频谱知道吸收波长的曲线有助于检测，如果有DAD，关系就不大。多组样本需要选择多个波长。相同的样品在徐璐不同的流动相和pH最大波长下可能不一致。具有双键共轭的结构具有较大的紫外线吸收能力，单键可以从低红外

7、区域吸收10个样品的复杂分层梯度方法分析字典处理，分为多个部分分析微量物质的财富，充分理解分离样品的性质，提供参考的分析条件，减少分析时间和分析难度。2.2明确的分析目的，1定量分析？能检测到什么物质呢？未知物品的确定？净化费？频谱的感情？2是否已卸下所有组件？一个茄子条件有困难吗？群组分析？3定量分析的准确性和精确度？(主要成分是12) 4徐璐其他样品气质对分离的影响(例如原料药、原油、名牌、残留、环境样品等)5分析工作量、小数还是大量？时间、效率和分离的选择。6 HPLC设备配置和等级等实验室条件柱系统是否有恒温；能否制作渐变，费用分析实验室职员操作技术方法的移植等。2.3样品的字典处理和

8、测试，样品源格式1应进行可直接注入的溶液(确保与流动相匹配)2稀释、pH缓冲、内部标记或其他操作3固体样品选择适当的溶剂4分离样品5字典处理。去除障碍物，特别是对仪器和柱子有损伤的物质。总之，将样品溶解在适当的溶液中。或者用适当的溶液提取或分离处理妨碍分离的物质，处理过程中要注意测试组的稳定性和提取率。根据大卫亚设、美国电视电视剧、健康、2.4 HPLC分析模式和样本的特性，分为两类茄子。a常规示例(2000DW)可以使用默认的标准方法。(中性，离子)反相，离子对，非物质反相，正常，离子交换。b特殊样品无机离子、异构体、对映体、生物样品、肽、核苷酸、大分子、蛋白质、核酸、糖类、合成聚合物。2.

9、5色谱条件，色谱条件主要包括流动相的组成和流量、温度等。频谱柱的类型样品处理方法检测器的确定及参数数据处理方法的稳定性等，2.6方法的最优化，颜色频谱现象的分析和处理，优化包括缩短分析时间，提高灵敏度，提高分离度，成本最优化，方法的稳定性等。针对仪器和样品的稳定性等发生的各种颜色频谱现象，提出了实用的方法。建立合理的数据处理方法等。2.7定性和定量方法的建立和论证，方法的检测限度、灵敏度、定量重复性、偏差、回收率、样品的稳定性、方法的稳定性、线性关系等的验证。建立可靠稳定的分析方法。选择三色频谱条件，选择3.1流动相3.1.1流动相试剂类型是典型的HPLC示例。正常，反转，离子对。正常试剂可以

10、添加正己烷、环己烷、正庚烷、戊烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙基乙酸盐、二氧六元、乙酸、乙醇、异丙醇、四氢呋喃等极性试剂，最好使用色谱纯试剂，但成本较高离子离子在试剂中使用强碱性和酸性的离子化合物，除了使用离子交换光谱外，还可以在流动上添加离子离子试剂，将其分离为C18柱。离子对试剂可分为两种茄子主要酸性和碱性分离聚羧酸的化合物，一般加入四丁基氢氧化胺、四丁基溴化胺、四丁基氯化胺等长链胺盐。也可以添加Na2SO4等无机盐，调节适当的pH值。分离碱性胺类化合物，一般加入八烷基磺酸钠、十二烷基磺酸钠等。反相颜色频谱试剂有机试剂最重要的是甲醇、乙腈、其他四氢呋喃、异丙醇、乙醇、二氧化六几乎看不见。甲醇的优

11、质分析酒精基本上可以满足分析，乙腈应该是色谱纯(时差，蒸发光散射)吗？可以使用分析顺序)，四氢呋喃可以应用新的，建议质谱或自行蒸馏。分析纯THF的少量添加勉强可以在高波场中完成。水理论上要求超纯，但实际上我们认为HPLCMS(飞行时间频谱)和HPLCELSD应该使用超纯。其他纯水、蒸馏水和类似的水质也可以。优质桶可以满足蒸馏水，纯水炉分析的要求。去离子水勉强可以，不能在低波长下使用。可以添加酸，一定量的无机酸和有机酸。无机酸对H3PO4、H2SO4、HClO4、HCl中的Cl对不锈钢管道有腐蚀作用，HNO3几乎没有氧化性。正常浓度为0.1%，pH值为23。有机酸包括甲酸、乙酸、三氟乙酸、柠檬酸

12、等。弱酸浓度为0.510。三氟乙酸是强酸的数量，如无机酸。加成的作用是抑制低pH时弱酸性物质的电离。延长保留时间，抑制拖车。第二，调节流动上的pH，起到缓冲作用。注意：流中的pH通常不能小于2。否则，频谱柱的寿命将缩短。无机盐和有机盐的种类很多，钾和钠的使用也很多。磷酸盐，硫酸盐乙酸盐。NA2HPO4、NAH2PO4、K2HPO4、KH2PO4、NA2SO4、NAC、柠檬酸钠、EDTA钠。胺试剂三乙胺、二乙胺、NH4OH等类似于离子对的作用，可以抑制C18中峰的牵引。第二，调节流动上的pH值。流动上的选择原则是非极性的一般有机溶剂和水力解决。添加极性样品、改性剂，控制pH值。离子样品，C18柱

13、可以用离子离子离子试剂，pH值处理，或者用离子交换树脂。3.1.2移动上的平衡甲醇水系统一般比较容易，30分钟内足够，短支柱时间比较快。在流动相中添加离子试剂，建议在实际工作中，首先使用一定比例的水平衡15分钟以上，然后改为离子离子的流动相，从而降低有机相比例，初步平衡，然后控制到适当的浓度。进山的话，相对平衡时间比较快，直接一般问题不大。改性剂、pH缓冲液、平衡时间取决于缓冲液的浓度和pH值。首先用水平衡一段时间，然后用缓冲液替换，浓度低，pH接近中性的时间长，浓度大的时间相对短。盐的浓度一般在0 . 010 . 05米之间，过高的盐浓度在有机相高温度低时容易析出。两三根柱子。分析结束后，首

14、先用水相去除无机盐，然后使用有机溶剂。选择3.2检测器，当前HPLC检测器为UV、DAD、ELSD、RI、FS、PAD、ED、MS(APCI、ESI)。最常用的是紫外线，主要是因为大部分物质在紫外线可视区200700，吸收能力强，一般合成的化合物(苯环最多)大部分有紫外线吸收。紫外线检测器有单波长和多波长的区别，至少可以达到190nm，最大900nm，多波长检测器可以同时选择多个波长测量，不同物质的紫外线吸收曲线不同，灵敏度差异大，相同物质的流动吸收曲线也不一致。紫外线检测仪是使用最多的，关键是波长选择。一般定律如下：分子足够大的话，紫外线区域总是有一定的吸收。对于小分子，小于2000，可以在

15、分子结构中判断或计算最大吸收波长。典型的含苯化合物在254纳米上具有共轭结构。通常有几个环，几个吸收棒。如果有对称结构，则最大波长通常小于230nm。嘧啶环，类似苯环结构的杂环。COOH，C=S，C=C都有红色变异现象，加入轭会更加明显。通常选择210230nm。染料的最大波长在可见光下，低紫外线吸收反而小，一般可以通过颜色来判断。DAD二极管阵列检测器(512，1024)的特点是执行频谱扫描，并获得三维色谱。其作用除了紫外线的功能外(灵敏度低于紫外线)，还能获得分离物质的紫外线光谱，对分离物质光谱的比较鉴别棒的纯度有一定的选择性。最大的优点是，分析时避免波长选择引起的关系，缺少一些颜色波峰，

16、从而获得未知的最大吸收波长。但是探测器的价格比紫外线高。视差探测器质量型探测器主要用于检测吸收的物质，而不是紫外线，如糖、酯类等。灵敏度比紫外线低一级，对所有物质都有反应。对温度敏感，仪器平衡长，不能进行梯度分析。ELSD探测器是90年代末普及的质量型探测器，主要替代RI探测器，具有与所有非挥发性物质相对应的优点，与其质量相关，经常表示非线性关系。可以进行渐变分析，对不挥发的紫外线吸收少的物质特别好。但是，有一个缺点，那就是易氧化的物质变质，没有被检测到的挥发性物质损失。流动相要求高，渡边杏含有不挥发的盐类，流动相有很大限制。ELSD目前主要包括Alltech 2000(500)、PL1000

17、、DDL31、SEDEX55、65、75等，并有两个茄子主要类别：分流和未分类。荧光检测器荧光检测器是荧光物质反应灵敏度高，一般常用于多环芳烃分析的特殊特性检测器。主要参数是发生波长和发射波长，发射波长大于发生波长，发生波长的确定可以通过紫外线扫描获得。传记化学探测器可以分为直流安培、脉冲安培、传导，安培用于传记活性物质检查，传导用于测量离子。频谱探测器HPLC的频谱探测器与GC不同，主要有APCI和ESI，分别有正离子和负离子。阳离子一般以添加Na、钾、氢的方式出现。其他类型的探测器，3.3样品的溶解和字典处理，样品的类型在前面已经提到过，分类。对于复杂的样品，根据分析要求和对象，必须有合理的提取方法，如溶剂提取、消氏提取、过层分析柱、超声波提取、皂化、衍生等。对于可直接溶解的样品，请注意，除非特别处理，否则测试样品的成分必须全部溶解。样品溶解的原则是相似性溶解，如果直接渡边杏或溶解低，最好先用其他溶剂溶解，然后用流动相稀释。在特殊情况下，可以用流动的溶剂溶解样品，溶解样品，但要注意量子极性的差异。(威廉莎士比亚、模