组培实验室的设计.ppt

1、第一章植物组织培养实验室的建构，第一节：商业的组织培养实验室和小工厂的修订和主要设备，主要内容：在进行实验室的修订仪器设备和仪器，植物组织培养作业之前，首先全面了解工作所需的最基本的设备条件，地产地利用现有的房屋，新建、改建实验室。 实验室的大小取决于工作的目的和规模。 以工厂化生产为目的，实验室规模过小，生产受到限制，影响效率。 在建设和修订组织培养实验室时，不要根据组织培养过程进行化学基整，而应避免一些环节跌倒，引起未来工作的混乱。 植物组织培养是在严格的无菌条件下进行的。 为了实现无菌条件，需要一定的设备、器材和工具，同时还需要人工控制温度、光、大气湿度等培养条件。 一、实验室设置修订、

2、组培实验室设置修订原则：保证无菌操作，达到工作便利，防止污染。组培实验室组成：标准组织培养室包括：洗衣房(区)配制室(区)灭菌室(区)储藏室(区)操作室(区)培养室(区)观察室(区)药品室(区)的主要设备：药品柜、防尘柜(放置培养容器)、冰箱、天平、蒸馏水器主要设备：水池、操作台、高压灭菌锅、干燥灭菌器(如电烤箱)等。 卧式灭菌锅，无菌操作室(接种室): 主要用于植物材料消毒，接种，培养物转移，试管苗传代，原生质体制备和无菌操作所需的技术计程仪程序。 主要设备：紫外线源、超纯台、消毒器、酒精灯、接种器具(接种大头针定径套、剪刀、解剖刀、接种针)等。 接种室不能小而大。 一般为78平方米，要求地

3、面、天花板及四壁尽量密封平滑，清洁和消毒方便。 把门拉出来，以减少开关门时的空气混乱。 要求干燥、安静、干净、明亮。 在适当的位置悬挂12个紫外辐射灭菌灯，照射灭菌。 最好安装小型空调，能够特罗尔节室温，关上门窗，减少与外界空气的对流。 在接种室应设缓冲问，面积以1m2为宜。 进入无菌操作室之前在这里换鞋子，减少出入时带入接种室的杂菌。 最好在减震垫之间也设置紫外辐射灭菌灯照射灭菌。超静台、酸修、培养室：培养室是培养生长接种材料的场所。 其大小可根据需要由培养架的大小、数量和其他附属设备决定。 原则上修订了空间的利用和节能。 高度比培养架稍高一点比较好，但周围的墙壁要求隔热防火的性能。 主要设

4、备：培养架(温控湿控)、摇床、孵化机、紫外线源等。 培养材料放在金属培养架上培养。 培养架一般设有5层，最低1层距离地面约lOcm，其他1层有30cm左右的间隔，培养架的高度为17m左右。 其长度根据荧光灯的长度进行设定，采用40W荧光灯的话，长度I3m、30W的长度lm、宽度为60cm。 培养室最重要的因素是温度，一般保持在2027左右，备有发热装置，装有窗式或立式空调机。 因热带植物和寒带植物等种类不同，要求温度不同，最好根据种类不同，有不同的培养室。 室内大气湿度也要求一定，相对大气湿度最好保持在70%，可安装增湿器。 通过控制照明时间，可安装定时开关时修正，有时一天需要10-16h的照

5、明，有时需要连续照明。 现代的组培实验室大多被修订为以天然太阳光为主要能量源，不仅能源节约，组培苗在太阳光的作用下生长良好，驯化容易生存。 下雨天可以用灯光弥补。细胞学实验室该室用于培养物的观察分析和培养物的订正数等。 主要设备：双筒望远镜立体显微镜、显微镜、倒置显微镜等。 小型仪器设备有分注器、血球校正器、移液器、过滤灭菌器、电炉等加热器具、磁力搅拌器、低速台式离心机等。 显微镜、显微镜、玻璃仪器和工具、玻璃仪器培养用：试管、三角瓶、培养皿等显微镜下观察用：细胞球微腔、载玻片、培养皿等。 微孔过滤烟嘴(细胞球过滤烟嘴) :荷尔蒙激素用于灭菌。 一般石棉过滤烟嘴，第二节：培养基及其配方，主要内

6、容：培养基的成分培养基的种类、配方及其特征培养基的配方1、培养基母液的配方2、培养基的配方，一、培养基的成分、大量元素体微量元素体氨基酸和有机附属物植物荷尔蒙(植物生长调节剂)维生素类凝固剂、大量元素体(植物生长调节剂)微量元素体(MS ) 氨基酸和有机附件(以MS培养基为例)、植物荷尔蒙(植物生长调节剂)、1、生长素类： IAA、IBA、2、4d、NAA等。 2 .细胞分裂素类： KT、6-BA、ZT等。 3、赤霉素类GA1-GA4、GA7、GA9-GA16、GA24、GA25等4，脱落酸： ABA 5、乙烯6、ph:5.6-5.8，培养基种类、配方及其特征液体培养基。 不同作用：诱导培养基

7、； 高附加值培养基、固定培养基。 不同培养过程：初代培养基、传代培养基。 培养基的配方和特点，参照教科书p1718，培养基的制备，母液(储备液)的制备和保存培养基的制备，Ms母液(储备液)的制备和保存，培养基的制备，1，在干净的不锈钢锅中加入750ml蒸馏水，加入必要的琼脂和砂糖，加热2 .加入储备液1、储备液2、各用蒸馏水定容至1L。 4 .调整h值。 一般. 5、培养基的分注。 6、缠绷带。 7 .培养基的高压灭菌。 培养基灭菌，高温高压蒸汽灭菌： 121，1.1 kg/c，15-20翅，时间过长，培养基成分容易变性的过滤灭菌：高温高压下容易分解的培养基和荷尔蒙激素类，第三节：外植体的选择

8、和培养， 主要内容：外植体选择外植体灭菌外植体接种和培养外植体成苗途径污染的原因和防治措施外植体褐变及其防治措施培养物玻璃化现象及其防治措施，一、外植体选择，一、外植体(Explant ) :指植物离体培养的各种接种材料。 包括植物各器官、组织、细胞球、原生质体等。 2、选择外植体的要求选择优良的种质：材料的选择是有目的的，有一定的代表性，提高成功率，提高实用性。 选择结实的植物：选择发育正常的脏器和组织，再生能力强，组织培养容易成功。 选择合适的大小：因植物而异，过大容易污染，过小容易形成愈伤组织，难以生存。 一般在0.5-1.0cm厘米之间。 选择最佳时期：一般在植物生长最适时的时期选择材

9、料，外植体类型为： 1、茎尖(应用于园艺植物的组织培养最多，繁殖率高，不易发生遗传变异，但取材有限) 2、茎段(利用嫩茎的切口促进腋芽发芽，取材容易) 3、3 4 二、外植体灭菌、外植体消毒是组培成败的首要步骤。外植体预处理：修整外植体，去除无用部分，流水下漂亮地清洗。 外植体表面灭菌：原则：在一盏茶灭菌，但不损害外植体的外植体不同，灭菌要求不同，灭菌药剂的使用和效果，常用灭菌方法(1)茎尖， 茎和叶等消毒：用洗涤剂洗涤-75%酒精中10-20min-无菌水洗23次或Naclo或水银升溶液泡沫10-15min-无菌水洗34次(2) 果实和种子根及地下器官的消毒：自来水清洗-纯酒精清洗-水银5-

10、10min或2%Naclo浸液10-15min-无菌水洗3次(4)药的消毒：自来水清洗70%表面消毒后，用无菌水漂洗材料3次以上除去残留抑菌剂，用酒精消毒与消毒剂接触的截平面在转移到无菌基质前必须切除，因为消毒剂阻碍植物细胞球对基质中营养物质的吸收。 如果外植体污染严重，必须先用水冲洗1小时以上，或者进行种子培养得到无菌种苗，然后在各个部位建立组织培养。 HgCl2效果最好，但对人的危害最大，使用后应用水清洗至少5次。 三、外植体的接种和培养，(一)外植体的接种-无菌操作是将表面灭菌后的植物材料从脏器、组织、细胞球分离，转移到无菌培养基的整个过程。 在接种中需要无菌操作。 外植体接种全过程，酒

11、精擦手，外植体消毒，浸泡5min，器械消毒，酒精灯灼，酒精擦培养皿，酒精擦酒，旋转灼烧，外植体擦，将接种，瓶塞牢牢盖上，修剪外植体，(2)外植，如在茎尖培养。 胚胎发育途径：50年代末期，Steward等人通过游离细胞的分化从胡萝卜韧皮部用液体培养基中获取胚状体。 据统订，在植物组织培养中具有胚状体分化能力的种子植物达117种，分为43科、75属。 培养基的荷尔蒙激素成分和氮源影响胚状体的发生。 有些植物在无荷尔蒙激素培养基中可以诱导胚状体，如烟、芒特罗尔、水稻、小麦花药培养，而有些植物则需要以生长素和分裂素的一定比例诱导胚状体，如油茶、枣、桃等。 在植物组织组织培养中，诱导胚状体与诱导芽相比

12、具有显着的优点，一个是数量多，二个是速度快，三个是成苗率高。 由于胚状体具有这些个优势，在育种和园艺工作中，胚状体不仅可以作为特定优良基因型个体的无性繁殖手段，对研究胚胎发育也具有重要的理论意义。 五、污染的原因及其防治措施，一、污染：植物组织培养中培养基和培养材料使杂菌繁殖，是导致培养失败的现象二、污染的原因一是致病菌污染(细菌、真菌) 2是外植体、培养基、培养器带菌3是操作人员不遵守操作规程。 真菌污染、污染防治措施、降低组织培养的污染率是工厂化生产中不可忽视的技术环节。 预防措施有：材料带菌防止-材料采集时间、材料和培养、外植体灭菌等措施的器具带菌防止- -器具和金属器具的灭菌作业室必须

13、为无菌状态-作业室、培养室灭菌等，操作人员必须按照操作步骤进行。 在培养基中加入抗生素分散接种，假设污染率为95%: 100枚材料，接种100根试管，即1枚/根。取得率为，P=(1-95%)100=5无菌材料200枚的材料，100根试管，即2枚/根接种。 P1(2污)=95% 95%=90.25% P2(1污1得或1得1污)=2 95%5%=9.5% P3(2得)=5%5%=0 3片/根进行接种时，制作8000根试管培养基，如果不放入2.4万片材料，则保持1根试管的无菌材料六、外植体的褐变及其防治措施、褐变、褐变，是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶激活，使细胞球内的酚类氧化成褐色醌类，这种

14、致死性褐化物不仅向外扩散使培养基变成褐色，还抑制了其他酶催化剂的活性，严重影响了外植体的脱分化和脏器分化， 最后发生褐变的领便当现象的基因型：外植体的大姨妈状态：一般幼龄材料、幼年器官和组织，春季采取外植体，褐变的发生较轻。 培养基的成分：培养基中的6BA或KT促进褐变的发生，IAA等生长素类减轻褐变的发生。 材料转变时间：防止褐变的措施，选择适当的外植体及最佳培养基：适当降低培养基的无机盐浓度，降低PH，降低分裂素水平等，显着减轻培养物的褐变的连续发生，抗氧化剂：向硫代硫酸钠金属钍，抗坏血酸活性炭添加多胺类，如精胺七、培养物玻璃化现象及其预防措施、玻璃化现象及其产生原因、培养物增殖培养时，分裂素浓度过高、分裂素和生长素的相对含量过高、培养基中的络离子种类、比例不当、琼脂浓度过低、不良培养环境过低、光照时间畸形、玻璃化现象、 作为玻璃化现象的预防措施，适当控制培养基中无机盐浓度适当特罗尔特罗尔培养基中的蔗糖和琼脂浓度适当降低分裂素和赤霉素浓度增加自然光，适当特罗尔光照时间改善温度改善培养皿气体交换状况向培养基中添加其他物质， 培养阶段容易出现的其他问题，白花苗，第四节：试管苗的驯化和移植主要内容： 1、试管苗的特征2、试管苗的驯化3、试管苗的