代谢工程在生物丁.ppt

1、生物丁醇代谢工程的研究进展,生技112班 吴鑫,传统丙酮丁醇梭菌遗传的改造,大肠杆菌的改造,为什么要发展生物丁醇,生物丁醇代谢改造过程中存在的问题,目前丁醇发酵的菌种主要是梭菌属。传统的丙酮丁醇乙醇( ABE) 发酵A B E 的比例为3 6 1，中国科学院上海植物生理生态研究所成功选育出了2 7 1丙酮丁醇菌种。科学工作者通过化学诱变和基因工程改造等手段得到了比较高产的菌株拜氏梭菌BA101 和丙酮丁醇梭菌PJC4BK，丁醇产量分别达到了15. 8 g /L 和16. 7 g /L。,生物丁醇是一种极具潜力的新型生物燃料,汽油,丁醇,乙醇,甲醇,热值 Btu/gallon,114,000,1

2、10,000,84,000,64,000,汽油,丁醇,乙醇,甲醇,辛烷值,96,94,92,91,亲水性弱，腐蚀性小，便于管道输送 能与汽油任意比混合 可替代或部分替代汽油做发动机燃料，缓减化石燃料的紧张 含氧量与甲基叔丁基醚(MTBE)相近 生物丁醇的生产原料淀粉、纤维素 等价格低廉。并且燃烧产物仅为二氧化碳和水 丁醇作为汽油的高辛烷值组份，可提高点燃式内燃机的抗暴震性，使发动机运行更平稳。,丁醛、丁酸,丙烯酸丁酯 (溶剂),邻苯二甲酸二丁酯 脂肪族二元酸二丁酯 (增塑剂),丁二烯,醋酸丁酯 (溶剂),丁胺,丁醇还是一种重要的平台化合物,酯化、取代、消去、氧化、还原,丁醇,聚丁二烯橡胶 丁苯

3、橡胶,目前生物丁醇制造面临的问题,丁醇毒性造成的产物浓度低 发酵产物中的丙酮和乙醇副产物的影响,导致丁醇发酵缺乏经济竞争力,pta 基因和ack 基因是生产乙酸的2 个必须基因，研究组用II 型内含子的方法插入失活了pta 基因，pta 基因突变体的丁醇生产能力却提高了46%。ack 基因突变体的丁醇产量提高了16%，乙醇产量则提高了63%。,从丁酰辅酶A 到丁酸也需要2 个酶的催化，分别是ptb 基因编码的丁酰磷酸转移酶和buk 基因编码的丁酸激酶。 ptb 基因突变体的乙醇产量只有0. 9 g /L，而丁醇的最终质量浓度为13. 9 g /L。 buk基因突变体丁醇的产量达到15. 2 g

4、 /L，比对照菌株的产量提高了29%。,从乙酰乙酰-CoA到丙酮也需要2 个酶的催化，分别由ctfAB 基因和adc 基因编码的酰基转移酶和乙酰乙酸脱羧酶。 ctfA 基因突变体丧失了丙酮生成能力，其丁醇和乙醇的生成能力相比对照菌株也下降很多; 而adc 基因突变体依然可以产生少量的丙酮，产醇表现则类似于ctfA 基因突变体。,Jang 等将pta 基因和buk 基因进行了双敲除，该研究中丁醇的产量提高到了18. 9 g /L，对葡萄糖的转化率达到31. 2%。相对于野生型菌株，这2 个指标分别提高了160%和245%。这也是迄今为止通过代谢工程手段获得的丁醇产量和转化率最高的丙酮丁醇梭菌突变

5、体。,糖,丙酮酸,乙酰-CoA,乙酰乙酰-CoA,3-羟基丁酰-CoA,巴豆酰-CoA,丁酰-CoA,丁醇,乙酸,乙醇,hbd,crt,磷酸烯醇式丙酮酸,琥珀酸,乳酸,Ter,atoB,adhE2,abdhE,frdBC,pta,ldh,大肠杆菌的改造示意图,James Liao 研究组首先实现了在大肠杆菌中生产丁醇。丙酮丁醇梭菌产丁醇途径中的hbd、crt、bcd、etfAB 和adhE2 基因在大肠杆菌中被成功表达，同时表达大肠杆菌自身的硫解酶基因atoB，打通了丁醇生物合成通道。进一步敲除了大肠杆菌内部的一些竞争途径的基因，包括: adhE、ldhA、frdBC、fnr、pta。该重组菌

6、株在M9 培养基中产生了113mg /L 的丁醇，在丰富培养基TB 同时添加甘油的条件下，该菌株可以生成552 mg /L 的丁醇。,为进一步提高丁醇产量，催化巴豆酰辅酶A 到丁酰辅酶A 的Bcd /EtfAB 蛋白复合体被替换为来自齿垢密螺旋体( Treponema denticola) 的Ter，同时表达了大肠杆菌自身的硫解酶基因phaA 和丙酮酸脱氢酶复合体aceEF-lpd操纵子，大肠杆菌的丁醇产量达到了4. 65 g /L。这与丙酮丁醇梭菌野生型丁醇产量13 g /L 相比仍有较大差距。但是他们进一步改造丁醇产量达到15g/L。,生物丁醇代谢改造中存在的问题,一、大肠杆菌为好氧发酵

7、二、丁醇丙酮丁醇梭菌为两阶段发酵改造为同型丁醇发酵。,结束语,a 生物丁醇作为汽油调和组分具有很大的发展潜力，是未来保障车用汽油燃料供给的可能途径之一，是生物乙醇的理想替代品。 b 国外生物丁醇技术虽然有小型生产或示范装置，但装置规模小，技术不成熟，实现规模化生产及应用尚有待时日。我国对纤维素生物丁醇的研发尚处于起步阶段，现有采用ABE 发酵工艺的厂家大多以玉米为原料生产丁醇，产物收率低，生产成本高，因此非粮食原料( 如薯类、纤维素等) 发酵生产丁醇是今后的发展方向。 c 实现生物丁醇商业化的关键是提高非粮食原料加工成丁醇的转化率，降低生产成本及装置投资，这取决于高效生物催化剂( 酶) 的开发和生产工艺设计的优化。,参考文献,生物丁醇代谢工程的研究进展戴宗杰