第四章 第2部分、肉毒梭菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌检验.ppt

1、第四节、肉毒梭状芽孢杆菌检验,一、肉毒梭状芽孢杆菌的生物学特性 1、形态与染色 肉毒梭菌属于厌氧性梭状芽胞杆菌属，革兰氏染色阳性，约为41m的大杆菌， 多单在，偶见成双或短链，两侧平行，两端钝园，直杆状或稍弯曲，芽胞为卵圆形，大于菌体宽度，位于次极端，使菌体呈匙形或网球拍状，偶有位于中央，常见很多游离芽胞。 有48根周生鞭毛，运动迟缓，无荚膜。,2、培养特性,最严格的厌氧菌 生长最适温度：28 37 ：pH为6.87.6，产毒的最适pH为7.8 8.2。 产毒培养温度：不同菌型产毒的最适培养温度不完全相同。C、D型温度高些为宜，35 培养3d即可，而E型菌低温度长时间培养效果较好。 对营养要求

2、不高 ：在普通培养基上都能生长。,肉毒梭状芽孢杆菌菌落,在固体培养基表面上，形成类圆形，边缘不整齐，约3毫米左右的菌落。菌落半透明，表面一般比较光滑也有的呈颗粒状，界线不明显，向外扩散。呈绒毛网状，常常扩散成菌苔。,肉毒梭菌的生化性状很不规律，即使同型，也常见到株间的差异。,3、肉毒梭菌的生化特性,表1 各型肉毒梭菌的生化反应,二、肉毒梭菌的致病性,肉毒梭菌能产生外毒素即肉毒毒素（大分子蛋白），根据毒素的抗原特异性将其分为A、B、C （1、2） 、D、E、F、G七个型别。与毒素型别相对应，肉毒梭菌也分为同样的七个型别。其中A、B、E、F四型毒素对人有不同程度的致病性。 A型毒素经602分钟加热

3、，差不多能被完全破坏，而B、E二型毒素要经702分钟才能被破坏；C、D二型毒素对热的抵抗更大些；C型毒素要经过902分钟加热才能完全破坏，不论如何，只要煮沸1分钟或75加热510分钟，毒素都能被完全破坏。肉毒毒素对酸性反应比较稳定，对碱性反应比较敏感。某些型的肉毒毒素在适宜条件下，毒性能被胰酶激活和加强。,肉毒毒素是一种神经麻痹毒素，主要抑制神经末梢释放乙酰胆碱，引起肌肉松弛麻痹，特别是呼吸肌麻痹导致死亡。 肉毒毒素的毒性极强，是目前已知在天然毒素和合成毒剂中毒性最强的生物毒素，据称，精制毒素1克能杀死400万吨小白鼠，一个人的致死量大概1微克左右。 肉毒中毒一年四季均可发生。美国以罐头发生中

4、毒较多，日本以水产品较多；我国以发酵食品（如：臭豆腐、豆瓣酱、豆豉等）发生中毒较多。,三、检验方法,1、检验标准：GB 4789.12-2003 2、培养基和试剂 培养基： 庖肉培养基、卵黄琼脂培养基、明胶磷酸盐缓冲液。 试剂： 肉毒分型抗毒诊断血清、胰酶（活力1:250）、革兰氏染色液。 另需实验动物（小白鼠）。,3、检验程序,检 样,毒素检测,增菌、产毒培养 30，5 d,报告 （一）,毒素检测,报告（二）,分离培养,培养检查,毒素检测,报告（三）,增菌产毒培养 30，5 d,观察生长性状， 染色镜检,观察菌落性状 染色镜检,报告(一)：检样中有无肉毒毒素以及有何型肉毒毒素。(如仅为了肉毒

5、中毒诊断，即可结束检验) 报告(二)：对增菌产毒培养物，一方面做生长特性观察，同时检测肉毒毒素。报告检样中有无肉毒梭菌以及有何型肉毒梭菌。（有些样品如土壤、泥沙等基本上不可能含有毒素，则应从培养着手） 报告(三)：欲获纯菌株，可用增菌产毒培养物进行分离培养，对所得纯菌株进行形态、培养特性等观察及毒素检测，其结果可证明所得纯菌为何型肉毒梭菌。（一般情况下，没有必要从检样中分离纯的菌株，但研究或特殊需要例外）,（1）、肉毒毒素检测,注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后24 h内发病、死亡。,液态或固体样品经过适当处理后离心，取上清液实验,上清液及其胰酶激活处理液,分别进行小白鼠腹腔注射，

6、各3只，每只0.5 mL，观察4 d,确证试验,毒力测定,定型试验,取庖肉培养基五支，煮沸10min15min，做如下处理： 第一支：急速冷却，接种检样均质液1 mL2 mL； 第二支：冷却至60，接种检样，继续于60保温10 min，急速冷却； 第三支：接种检样，继续煮沸加热10 min，急速冷却。 第四支：急速冷却，接种肉毒梭菌菌种。 第五支：急速冷却，作为空白对照。 以上5支试管于30厌氧培养5d，若无生长，可再培养10d。培养到期，若有生长，取培养液离心，以其上清液进行毒素检测试验，方法同上，阳性结果证明检样中有肉毒梭菌存在。,（2）、肉毒梭菌的检出（增菌产毒培养试验）,选取证实含有肉

7、毒毒素的增菌产毒培养物（必要时可重复一次适宜的加热处理）接种卵黄琼脂平板，35厌氧培养48 h。肉毒梭菌在卵黄琼脂平板上生长时，菌落及周围培养基表面覆盖着特有的虹彩样(或珍珠层样)薄层，但G型菌无此现象。 根据菌落形态及菌体形态挑取可疑菌落，接种庖肉培养基，于30培养5d，进行毒素检测及培养特性检查确证试验。,（3）、分离培养,（1）毒素检测：试验方法同上。（2）培养特性检查：接种卵黄琼脂平板，分成两份，分别在35的需氧和厌氧条件下培养48 h，观察生长情况及菌落形态。肉毒梭菌只在厌氧条件下生长而在需氧条件下不生长。,4、结果报告,报告(一)：检样含有某型肉毒毒素。报告(二)：检样含有某型肉毒

8、梭菌。报告(三)：由样品分离的菌株为某型肉毒梭菌。 肉毒梭菌检验目标主要是毒素，不论食品中的肉毒毒素检验还是肉毒梭菌检验，均以毒素的检测及定型试验为判定的主要依据。,第五节、副溶血性弧菌检验,一、生物学特性 1、形态与染色 革兰氏阴性无芽胞多形态杆菌或稍弯曲弧菌 ，有时呈棒状、甚至球状、丝状等。单端鞭毛。无芽胞、无荚膜。,2、培养特性,需氧或兼性厌氧 嗜盐，在2%NaCL培养基中生长最好，无盐或食盐10%不能生长。 最适温度36，pH7.57.8 在固体培养基上菌落呈圆形凸起，混浊不透明，表面光滑，较湿润，边缘不整齐。 在血平板上可见溶血环。,3、生化特性,分解葡萄糖产酸不产气，不分解乳糖，蔗

9、糖。 H2S（）、V-P（）、靛基质（+）、精氨酸（） 甲基红（+）、赖氨酸（）、溶血/-,O抗原：O1O13 13种。 H抗原： K抗原：K1K71 65种。 （ 缺编：K2 、 K14 、K17、 K35、 K62） 血清分型：所有副溶血性弧菌的H 抗原均相同，但是O 抗原和K 抗原存在差异，以13种O抗原及65种K抗原将其分为13个群和845个型。,4、抗原结构,二、致病性,1、致病因素 侵袭力：活菌(105107/g)，可使人致病 . 产生溶血毒素：耐热性溶血毒素(THD)和耐热性溶血毒素相关的溶血毒素(TRH)，此外有的可产生不耐热溶血毒素(TLH)。,2、媒介食品 主要是海产品（鱼

10、、虾、蟹、蛤等），含盐量较高的食物亦可带菌。 3、所致疾病 食物中毒、急性胃肠炎、败血症等。,1、检验标准：GB/T 4789.7-2008 副溶血性弧菌检验 2、培养基和试剂 培养基：3氯化钠碱性蛋白陈水APW) 、 硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂 3氯化钠胰蛋白胨大豆TSA）琼脂 3氯化钠三糖铁（TSI）琼脂 嗜盐性试验培养基 3氯化钠甘露醇试验培养基 3氯化钠赖氨酸脱狡酶试验培养基 3氯化钠MR-VP培养基 我妻氏血琼脂、弧菌显色培养基 试剂：氧化酶试剂、革兰氏染色液、ONPG试剂、3%氯化钠溶液、 V-P试剂、API20E生化鉴定试剂盒等。,三、检验方法,3、检验程序

11、,（1）样品处理及培养 定量测定：样品用3%氯化钠蛋白胨水 10倍连续稀释后取三个稀释度各接3支含有该培养基的试管，培养。 定性检测：用上述1:10稀释液增菌培养。 （2）分离：有菌生长的试管分别接种TCBS平板或弧菌显色培养基平板上划线分离、培养。 （3）纯培养：挑可疑菌落划线分离。 （4）初步鉴定：生化实验和镜检鉴定。 （5）确定鉴定：生化试验鉴定。 （6）报告 定性检测或定量检测。 （7）血清学分型：（选做） （8）神奈川试验：,分离：在所有显示生长的试管或增菌液中用接种环沾取一环，划线分离。 副溶血性弧菌在TCBS琼脂平板上的典型菌落： 圆形、半透明、表而光滑、质感类似口香糖、直径2m

12、m3mm的绿色菌落。（培养基中含溴麝香草酚兰和H2S指示剂 ，因副溶血性弧菌不分解蔗糖、不产H2S，为绿色菌落）,副溶血性弧菌,混合菌种,副溶血性弧菌在弧菌显色培养基上典型菌落特征： 呈圆形、半透明、表面光滑的粉紫色菌落，直径2mm3mm。,初步鉴定：,挑取纯培养的单个可疑菌落，进行副溶血性弧菌的初步鉴定：,副溶血性弧菌： 氧化酶试验：阳性。 涂片镜检：G-，棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞，有鞭毛。 3氯化钠三糖铁斜面 ：底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深，有动力。 嗜盐性试验：分别接种于不同氯化钠浓度的胰胨水中培养，在无氯化钠和10氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长，在7氯化钠

13、的胰胨水中生长旺盛。,生化试验：分别接种各类生化培养基，培养后观察结果。 或API20E生化鉴定试剂盒或VITEK全自动微生物检测系统鉴定。 生化性状符合下表要求时，为副溶血性弧菌 。,确定鉴定:,表 副溶血性弧菌的生化性状,定性检测：报告25g（ml）样品中是否检出副溶血性弧菌。 定量检测：根据证实为副溶血性弧菌阳性的试管管数，查MPN检索表，报告每克（毫升）副溶血性弧菌的MPN值。,报告：,神奈川试验：,测试副溶血性弧菌分离株是否存在特定溶血素（与致病性显著相关）。将测试菌点种在我妻氏血琼脂平板上，培养后观察是否有溶血现象。阳性结果为菌落周围呈半透明环的溶血。,第六节、蜡样芽胞杆菌,（一）

14、生物学特性 1、形态与染色 革兰氏阳性大杆菌，宽度在1 m或1 m以上，芽孢呈卵圆形，不突出菌体，多位于菌体中央或稍偏于一端。,需氧，最适生长温度3032。 在肉汤中混浊生长，有菌膜或壁环，振摇易乳化。 在普通琼脂平板上，菌落灰白色，不透明，边缘不整齐，表面粗糙，呈毛玻璃状或白蜡状。 在血平板上，菌落呈浅灰色，不透明，似白色毛玻璃状，有溶血环。 在甘露醇卵黄多粘菌素平板上，菌落呈粉红色，具有白色混浊环（不发酵甘露醇、产生卵磷脂酶）,2、培养特性,能分解葡萄糖，麦芽糖，蔗糖，水杨苷，产酸不产气。 不分解乳糖，甘露醇，阿拉伯糖，山梨醇，木糖 H2S（-），尿素酶试验（-）卵磷脂酶（+）， V-P试

15、验（+），液化明胶。,3、生化反应,食品蜡样芽胞杆菌数量106/g（mL）时常可导致食物中毒，导致中毒的主要原因是其产生的肠毒素 。 肠毒素类型： 耐热性肠毒素：10030min不能被破坏，常在米饭中形成。 不耐热肠毒素：能在各种食物中形成。 临床症状：食物中毒，分为呕吐型和腹泻型两类。,二、致病性,三、检验方法,1、检验标准； GB 4789.142003 2、培养基和试剂 培养基: 肉浸液肉汤培养基 酪蛋白琼脂培养基 动力-硝酸盐培养基 缓冲葡萄糖蛋白胨水 血琼脂培养基 木糖-明胶培养基 甘露醇卵黄多粘菌素(MYP)琼脂培养基、 试剂：0.5%碱性复红染色液、革兰氏染色液、3%过氧化氢溶液

16、、甲萘胺-乙酸溶液、对氨基苯磺酸-乙酸溶液。,3、检验程序,361 12 h 20 h,37，18 h 24 h,361 12 h 20 h,检 样 25 g（mL）加225 mL生理盐水,菌数计算,做成10-110-5的稀释液,选择性培养基 （分离培养） MYP,营养琼脂培养基,生长及菌落观察,染色镜检,生化试验,菌株保存,报 告,选择性培养基 （菌数测定） MYP,包括四个步骤： 菌数测定:涂布甘露醇卵黄多粘菌素（MYP） 平板计数。 分离培养:从MYP上 挑可疑菌落进行纯培养。 证实实验:包括形态观察、培养特性、生化性状和生化分型试验。 与类似菌的鉴别：主要是与苏云金芽孢杆菌的鉴别。 结

17、果报告：报告每g（mL）检样中所含的蜡样芽孢杆菌数。,将样品稀释液0.1 mL涂布于甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂平板上培养后，选取适当菌落数的平板进行计数。计数后，从中挑取5个典型菌落做证实试验。根据证实的蜡样芽孢杆菌的菌落数计算出该平板上的菌落数。 蜡样芽孢杆菌数=可疑菌落数证实为阳性菌落数的比例稀释倍数10,菌数测定：,MYP培养基中含有卵黄、甘露醇、多粘菌素和pH指示剂酚红等。多粘菌素可抑制杂菌的生长。 蜡样芽孢杆菌不发酵甘露醇，菌落为粉红色（否则为黄色）。 该菌产生卵磷脂酶，由于脂肪和卵磷脂被分解，在菌落周围产生粉红色的晕。,分离培养和证实试验:,分离培养：从MYP平板上挑可疑菌落

18、到营养琼脂上进行纯培养。 证实试验： （1）形态观察 （2）培养特性（3）生化性状及生化分型 生化性状 本菌有动力；能产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧化氢酶试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖；常能液化明胶和使硝酸盐还原；在厌氧条件下能发酵葡萄糖。生化分型 根据蜡样芽孢杆菌对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、V-P反应、明胶液化性状的试验，分成不同的型别。,表1 蜡样芽孢杆菌生化分型,表2 蜡样芽孢杆菌与其他类似菌的鉴别,与类似菌鉴别：,鉴别： 蜡样芽孢杆菌在形态以及生化性状上与苏云金芽孢杆菌极为相似 ，要进行鉴别。主要是通过观察伴孢晶体来判断，苏云金芽孢杆菌有伴孢晶体，蜡样芽孢杆菌无。,苏云金芽孢杆菌及其伴孢晶体,蜡样芽孢杆菌,第七节、其它致病菌的检验,一、单核细胞增生李斯特氏菌检验 GB 4789.30-2010 食品