3-HPLC 色谱柱介绍ppt课件.ppt

1、Waters HPLC色谱柱,Waters 色谱柱发展历史,Styragel,Bondapak,DeltaPak,1964,1979,1973,1992,Symmetry,Spherisorb,Atlantis,Symmetry 300,XTerra,XTerraPrep,1998,Nova-Pak ProteinPakTM Pico-TagTM,SymmetryShield,1984,1986,2002,1999,1994,2003,Atlantis HILIC Silica Prep OBD Intelligent SpeedTM BioSuite NanoEase,2004,ACQUIT

2、Y UPLC BEH SunFire Columns,PrepPak,1976,1958,Atlantis T3 ACQUITY UPLC HSS T3 AccQTagTM Ultra,2006,2005,XBridge,2007,ACQUITY UPLC HSS C18 and HSS C18 SB,2008,XBridge HILIC,2009,ACQUITY UPLC BEH Amide ACQUITY UPLC BEH Glycan XBridge Amide XSelect HSS HPLC Columns,2010,ACQUITY UPLC BEH200 SEC XSelect C

3、SH HPLC columns ACQUITY CSH Columns Viridis SFC Columns ProteinPak High Rs IEX,AccQTagTM,2011,ACQUITY UPLC HSS Cyano P/N:186002350 2010药典人参含量测定，通过将HPLC方法转换成UPLC方法，分析时间由 120min缩短到10min,2010药典人参含量测定,键合相提供不同选择性,方法开发中全能型色谱柱!,特殊键合相满足特定需求Shield RP18：内嵌极性基团C18,通过极性嵌入基团保留水 可完全兼容100%水相 屏蔽硅醇基，对碱性化合物峰形更佳 提供与C1

4、8不同的选择性,Shield RP技术改善碱性峰形实例（XBridge RP18有更宽pH范围， pH 2-11！）,pH 7.0,注：所示色谱柱性能比较情况，与具体操作条件相关，可能不能代表所有应用情况（法律申明）,阿奇霉素各国药典方法,XBridge Shield RP18最适于阿奇霉素分析,国家食品药品监督管理局关于修订阿奇霉素氯化钠注射液和阿奇霉素葡萄糖注射液药品标准有关事宜的公告,照高效液相色谱法（中国药典2005年版二部附录V D）测定，采用硅胶表面经杂化处理的十八烷基键合硅胶色谱柱如XBridgeTMShield RP18（规格：2504.6mm，5um）或与之相当的色谱柱，柱温

5、30；以乙腈-磷酸盐缓冲液（取0.05mol/L磷酸氢二钾溶液，用20%磷酸调节pH值至8.2）（58：42）为流动相；流速为每分钟1.0ml；检测波长为210nm。,Hilic 模式色谱柱:XBridge Amide T3对 dC18色谱柱的稳定性进行了更好的提升,切实增强对极性化合物的保留,1. Thiourea 2. 5-Fluorocytosine (B) 3. Adenine (B) 4. Guanosine-5-monophosphate 5. Thymine,注：所示色谱柱性能比较情况，与具体操作条件相关，并不代表所有应用情况（法律申明）,HSS T3分析OTC感冒药活性成分,2

6、010药典复方丹参滴丸,应对高容量和峰形柱效的需求,色谱工作者的需求和问题： 柱效？！ 柱容量？！ 载样量高？！ 中-低pH条件下碱性化合物拖尾严重？！ 样品杂质或相关物质分析及分离？！,4,8,12,对碱性化合物峰形更佳的更优质硅胶色谱柱,5,1,Vo,2,3,4,Symmetry C18 5 m USP Tf = 1.69 N = 6961,以Amitriptyline（峰5）计算拖尾因子USP Tf pH7条件下,SunFire C18 5 m USP Tf = 1.26 N = 8203,CSH表面带电杂化颗粒技术的键合相产品,CSH C18 三点键合 C18 广泛的pH使用范围 pH

7、 1 - 11 卓越的峰形与柱效，无论是典型缓冲盐流动相体系还是低离子强度流动相体系 130A CSH C18 多肽和小分子蛋白，0.1%FA 具有卓越的上样量 CSH Phenyl-Hexyl （苯己基，USP L11) 三点键合 C6-Phenyl 广泛的pH使用范围 pH 1 - 11 对于芳香性分析物提供互补的选择性 CSH Fluoro-Phenyl（氟苯基，USP L43） 三点键合的、未经封端的、五氟苯基 pH 1 8 与烷基柱相比具有独特的选择性 稳定的、重现的生产控制,对碱性分析物有卓越的峰形与载量尤其适合LCMS流动相条件,丙咪嗪浓度保持恒定为 0.5 mg/mL; 使用利

8、于LCMS分析的0.1% 甲酸流动相条件,2.0 %,1.0 %,0.5 %,0.1 %,丙咪嗪,2.0 %,1.0 %,0.5 %,0.1 %,Amitriptyline,ACQUITY CSH C18 1.7 m 0.1 % formic acid,Superficially Porous C18 1.7 m 0.1 % formic acid,观察 CSH技术对碱性物质有卓越的峰形，特别是使用兼容LCMS检测的流动相条件时。 特别有利于对低含量物质的检测，有好的峰形、分离度与灵敏度。,丙咪嗪,阿米替林,阿米替林,覆盖全部现代反相色谱柱的选择性范围BEH + CSH + HSS:,ACQU

9、ITY BEH Phenyl XBridge Phenyl,ACQUITY BEH C18 XBridge C18,ACQUITY BEH Shield RP18 XBridge Shield RP18,ACQUITY BEH C8 XBridge C8,ACQUITY HSS C18 SB XSelect HSS C18 SB,ACQUITY HSS C18 XSelect HSS C18,ACQUITY HSS T3 XSelect HSS T3,ACQUITY CSH C18 XSelect CSH C18,ACQUITY CSH Phenyl-Hexyl XSelect CSH Phe

10、nyl-Hexyl,ACQUITY CSH Fluoro-Phenyl Xselect CSH Fluoro-Phenyl,ACQUITY HSS CN XSelect HSS CN,ACQUITY HSS PFP XSelect HSS PFP,内容,色谱柱应用基础 HPLC色谱柱介绍 色谱柱使用保养知识,色谱柱的连接,各种锥箍和管路接头长度示意图:,色谱柱的连接,Stop_depth长度不合适造成柱前死体积 柱外扩散,造成色谱峰展宽,死体积,正常,峰扩散,色谱柱的连接,锥箍锥度不合适造成渗漏,测柱效-良好的色谱实验习惯,拿到一根新色谱柱时，先测柱效 保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录色谱

11、测试条件 定期检测柱效 定期检测仪器的谱带展宽,测柱效的方法,色谱柱种类繁多,性能各异,测定方法亦各不相同 Waters的色谱柱均附有Use and Care说明书,可按说明书所述方法测定 如若柱盒中无纸质说明书，请到以下网址获取 样品:50mg Acenaphthene(二氢苊)溶于100ml乙腈,加入600l丙酮 进样量13l 检测波长:254nm,计算色谱柱的柱效 N,理论塔板数计算公式： Ws 方法 Wtan16切线法 Wh5.54半峰高 W3s9 3s W4s16 4s W5s25 5s,Inject,Inject,用“切线”法计算柱效,不好的色谱柱的柱效反而比好色谱柱的要高，因为其

12、拖尾部分测不出来,好柱,坏柱,好柱,Inject,Inject,用“5”法计算柱效,坏柱,测量色谱系统的谱带展宽,卸下色谱柱，用UNION(两通)代替之 按测柱效方法，以1/10的样品浓度进样，大约25微升 用5 sigma方法测4.4%峰高处的峰宽：W 仪器参数 流速1.0 ml/min 检测器时间常数小于0.2 谱带展宽（ml）=1000W（min）,色谱柱的正确使用及操作,流动相的转换 特别是GPC柱 流速(压力)的变化幅度 温度的变化幅度 专用色谱柱样品及溶剂的要求,正确使用色谱柱(一),样品方面 除去微粒及杂质 了解样品在流动相中的溶解度 如溶样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶

13、解度，防止其在流动相中析出 了解样品与色谱柱的基质/填料是否有相互作用,正确使用色谱柱（二）,流动相方面 除去微粒 纯度的要求 超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内 缓冲液（盐）的浓度 有机溶剂：色谱纯,杂质含量尽量低,并与填料相匹配 流动相对样品的溶解度 有机溶剂或水的比例,色谱柱的在线保护装置,给色谱柱提供物理的保护 除去样品及流动相中的颗粒 给色谱柱提供化学的保护 防止分析柱被化学污染 装置 在线过滤器 Sentry Guard 保护柱,在线过滤器,In-Line Filter，部件号 WAT084560 防止颗粒在色谱柱头累积 优点：基本不影响柱效 在需要高柱效的分析时常用(如：氨基酸分析) 可更换的消耗品 更换滤芯，部件号 WAT088084 (1/pkg) 更换滤芯，部件号 WAT005139 (5/pkg),保护柱,可避免化学污染 多数保护柱影响到整个色谱柱的柱效，特别是在用微柱时 选保护柱的原则 与所用色谱柱品牌、内径一致 Sentry Guard保护柱 通用保护柱卡套部件号: WAT046910(适用于3.0,3.9,4.620mm保护柱) 186000262 (适用于2.120mm保护柱) WAT097958(适用于2.110m