HK基因的选择和性质.ppt

1、06336029:21，1，HK基因的选择与性质，徐秀竹2010.1.20，06:29336021，2，1。HKG选集，1。实时反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术简介：由于其对选定基因的敏感性、特异性和高通量，RT-PCR是用于微阵列数据验证和小基因组的分子诊断的最常用方法，并且在细胞数量少时特别有用。逆转录聚合酶链反应技术的主要问题是数据标准化不当。已经使用了各种策略来控制基因表达的结果。当只有少量的核糖核酸时，很难定量总核糖核酸(06336029336021，3)。此外，它只能测量总核糖核酸的一小部分样本。因此，HKG是标准化基因分数的黄金标准。然而，常用的HKG基因表达有相当大的变化

2、，这将增加实验噪音，并可能最终导致错误的结果。为了检测最稳定表达的HKG，我们使用了来自13629个已发表的人类基因组的大量表达数据集，并整合了基因表达水平的丰度和稳定性。用2543个小鼠样本证实了人类结果。数据处理：1 .从两个平台下载13629个可用样本的微阵列表达数据。该样本集包含不同组织和不同实验条件的基因表达数据。2.两个平台上可用的探针组被转换成正式的基因名称，如果多个探针对应于同一基因，则取平均表达值。3.使用分位数规范化来处理数据，然后使用log2来转换表达式值。06:29:21，4，06336029:21，5，结果和讨论：候选HKG被定义为：最稳定表达的基因，即具有小变异系数

3、和最大变化2的基因(MFC，在数据集中观察到最大值与最小值的比率)。此外，平均表达水平低于最大表达水平减2的偏差是候选基因的先决条件。06:29:21，6，13037在13629个不同样品组中使用了独特的基因表达水平。表1显示了检测到的前15名候选HKG。15个基因的变异系数均低于4%，变异系数低于0.49。此外，最大似然值从1.41 (RPL 27)到1.99 (RPS 12)不等，反映出这些候选HKG在大数据集上的表达略有不同。这15个基因中有13个编码参与蛋白质合成的核糖体蛋白质。表达水平分布如下：图1a，06:29336021，7，下面研究常用HKG(如ACTB、GAPDH、HPRT1

4、、B2M)的表达水平。这些常用HKG的表达水平波动很大。(表2)，06:29:21，8，MFC范围从1.91(ACTB)到15.15(ALDA)。然而，在12个常用的HKGs中，只有一个(ACTB)基因的变异系数低于5%，这反映了在大数据集中常用的HKGs具有很大的变异水平。值得注意的是，在检测到的50个候选港元中，没有一个常用港元排名靠前。常用HKG的表达水平分布如下：图1b，06336029336021，9。为了证明使用这些新候选HKG的可行性，我们为前15个候选HKG建立了5个引物(如RPL27、RPL30、OAZ1、RPL22、RPS29)。我们用聚合酶链反应检测理想产物的长度和特异性

5、，没有假的(图2)，06:29:21，10，为了验证检测到的新候选HKG更稳定，我们使用了另一个哺乳动物模型系统(小鼠)。使用了2543个不同小鼠样品组中21377个独特基因的表达水平。在人类数据集中检测到的新候选HKG在小鼠实验中也显示出稳定性。(表3)。此外，在小鼠实验中，编码核糖体蛋白的基因也表达最稳定。因此，检测到的候选HKG表达的稳定性也在另一物种中得到验证。06336029:21，11，(2)结论：1。新候选人HKG在不同的细胞和实验条件下比常用的HKG表达更稳定。2.基于无处不在和稳定表达的定义，结果表明没有一个基因有资格被称为“真正的”HKG。3.在超过90%的情况下，GAPD

6、H和ACTB可用作单一控制基因。4.多年来，常用的控制基因被认为是定性变化测量技术中的良好参考，因为这些基因在几乎所有基因中都有高水平的表达。然而，逆转录聚合酶链反应的出现侧重于定量变化，并要求重新评估这些HKG。06336029:21，12，5。新候选人HKG在功能上没有很大变化，他们主要是参与蛋白质合成的核糖体蛋白。因此，研究这些特定细胞过程的实验者有可能更好地利用通过我们的分析获得的其他候选HKG。6.使用荟萃分析，我们可以发现在不同的组织类型和实验条件下，候选HKG的变化水平低于常用的HKG。检测到的新候选HKG可用于几乎所有未来的逆转录聚合酶链反应实验，没有任何限制。06336029

7、:21，13，2。选择HKG进行逆转录聚合酶链反应标准化，(1)引言：实时逆转录聚合酶链反应是检测低丰度基因的最敏感方法，具有不同的应用，如临床诊断、促甲状腺激素表达分析和植物研究。为了避免偏见，逆转录聚合酶链反应需要参考内部控制基因。理想情况下，实验条件不应影响这种内部控制基因的表达。然而，许多研究表明，内部标准(主要是HKG用于量化基因表达)可能会随着实验条件的变化而变化。根据现有的结论，内标应该至少有两到三个HKG，因为使用单基因标准化可能会导致相对较大的误差。06:29:21，14，目前，至少有9种HKG能很好地表达信号。最常用的是甘油醛-3-磷酸脱氢酶、核糖体基因、亲环素、肌动蛋白、

8、延长因子1-a (ef1a)、微管蛋白、腺嘌呤磷酸转移酶(aprt)。本文研究了与晚疫病相关的7个hkg (18srrna、亲环素、肌动蛋白、ef1a、aprt、微管蛋白、核糖体蛋白L2)和hsp20.2基因。为了评价其用于表达研究的内部控制值，在生物刺激(晚疫病)和非生物刺激(寒冷和盐)下对马铃薯进行了研究。植物材料和刺激处理。1.二倍体和三倍体杂交鉴定晚疫病抗性相关数量性状位点。在田间试验中，这些性状位点对表型的贡献为43%。三七马铃薯分别命名为00R1、01R1、11R1，使用代表目标QTL的类别来增加抗性。晚疫病感染后1、2和3周采集植物样品。为了在同一个逆转录聚合酶链反应实验组中放置

9、尽可能多的完整样品序列，样品01RT2被删除。06:29:21，15，2。盐和冷刺激四倍体马铃薯品种。冷刺激治疗是把土豆放在4。对照组为20。盐刺激组用100毫升氯化钠溶液浸泡，对照组用水浸泡。浸泡0、1、3、8和14天后取样。06336029:21，16，06:29336021，17。结果，为了评价HKG表达的稳定性，测量了每个刺激下所有样品的核糖核酸转录水平。图2显示了7个hkgs和感兴趣基因的RNA转录谱。18S rRNA表达水平最高(低螺旋CT)。三种刺激下的CT值相似，如图2所示。不管什么样的刺激，根据它们的表达水平，基因序列是相同的。在不同的刺激下，核糖核酸的转录水平是不同的，这可

10、以通过f检验得到。肌动蛋白是晚疫病和盐刺激的最大改变基因。冷刺激下无显著差异。06:29:21，18，为了选择最佳的HKG，使用了基因组分析。范德姆普尔等人定义了两个参数来量化HKG的稳定性：M(平均表达式稳定性)和V(对变化)。M值低表示表达相对稳定，因此增加了特定基因作为控制基因的适应性。此外，建议0.15作为阈值v。当它低于0.15时，没有必要包括另一个对照基因。根据不同的刺激，更稳定的HKG是不同的(图3)。晚疫病最稳定的基因是ef1a和18S rRNA，它们的M值为0.217，V值为0.070。因此，没有必要添加第三个基因作为控制基因(图3)。，06336029336021，19，在

11、冷刺激下最稳定的两个基因是ef1a，L2。m值为0.408，V值为0.165，因此有必要添加第三个基因作为内部控制。盐刺激最稳定的两个基因是ef1a和亲环基因。m值是0.305，v值是0.119，所以只需要两个基因。06:29:21，20，(Hsp20.2的表达和感兴趣基因的表达水平根据geNorm进行定量。基因型00R1晚疫病后1周，Hsp20.2基因表达增加，并持续2-3周。对于其他基因型，无论疾病何时发生，Hsp20.2的表达水平都保持不变。在基因型00R1中，一周后表达水平增加了2.5倍。对于晚疫病，这种基因型是所研究的基因型中最敏感的。(图4a)在冷刺激下，在4。一天后，Hsp20.

12、2的表达增加。治疗3天后，基因表达水平最高，比对照组提高了15.6倍。3天后，表达水平下降并达到初始表达水平。(图4b)，b)，06:29:21，21，在盐的刺激下，表达水平增加直到处理后14天，并且在14天后获得最大表达水平。第14天，与对照组相比增加了4倍。(图4c)许多作者使用18S rRNA作为唯一的内部对照来量化基因表达水平。因此，Hsp20.2的表达水平由一个内部对照(18S rRNA或ef1a)和两个或三个表达最稳定的HKG来量化。例如晚疫病：18S rRNA ef1a；盐刺激：ef1a亲环素冷刺激：ef1a L2 aprt。06:29:21，22，根据所使用的内部控制，量化是不

13、同的。与使用18S rRNA相比，使用ef1a作为内部对照并未显著改变Hsp20.2表达水平的量化。然而，当使用18S rRNA作为唯一的内部对照时，盐和冷刺激下的表达定量被低估了。06:29:21，23，讨论：1。为了使相对逆转录聚合酶链反应准确，必须确定特定的聚合酶链反应条件和合适的内部控制。2.一个可靠的内部控制应该显示最小的变化，但是感兴趣的基因在实验过程中可能会发生很大的变化。因此，选择内部控制对于量化基因表达非常重要。如图4所示，量化的差异取决于HKG的选择和数量。3.文献中的大多数研究使用独特的内部控制。肌动蛋白是一种常用的标准化表达定量基因。然而，在这项研究中，这种基因在某些情

14、况下并不是最好的。06:29336021，24，4.18S 4.18s和28S核糖体亚单位是另一个有争议的常用内部控制的例子。事实上，当直接比较其他HKG时，它们的表达水平是非常稳定的。Thellin等人建议使用18S和28S rRNA作为基因定量的内部标准，因为基因变化非常微弱，不可能极大地改变总的核糖核酸水平。关于用rRNA作为内部控制的几个争议：(1)核糖体亚单位的转录受生物因素和药物的影响；使用18S和28S rRNA分子作为标准的其他缺点是(2)它们在纯化的基因样品中不表达，和(3)它们与靶基因相比具有高丰度。这使得在精确的逆转录聚合酶链反应数据分析中很难减去起点。06336029:

15、21，25，4。标准化的目的是消除样本差异，以便识别真正的基因特异性变化；然而，传统的基于单基因的标准化策略可能会导致标准化错误。总之，选择内部控制来规范hsp20.2的表达水平是非常重要的。在本研究中，ef1a是三个实验中唯一可以规范的HKG。该基因不受寒冷、盐和晚疫病的影响，因此可用于标准化感兴趣基因的表达水平。(1)基于表达序列标签的证据(1) HKG在所有组织和细胞类型中处处表达，并构成维持基本细胞功能的基本转录组。将转录组分为HKG和TSG，并根据它们的基因组结构、系统发育年龄、进化速度和转录调控来描述这两组基因，是理解人类转录组的基础。2.基于可公开获得的科技英语数据，我们发现大部

16、分(40%)目前标记的基因普遍表达。06336029:21，26，3。我们证明了HKG在总体上是高度表达的，并且它在编码序列上的进化比TSG慢。然而，我们的分析使人们怀疑HKG比促甲状腺激素更紧凑，减少了启动子保护。4.此外，我们表明HKG通常比TSG更老，并且具有非常独特的核心启动子结构。06336029:21，27，06336029:21，28，(2)基因结构我们研究了18个人类组织中17288个人类参考序列位点的表达宽度，并分别定义了所有18个组织中的HKG和仅一个组织中的促甲状腺激素。1.我们观察到基因的长度参数与表达宽度正相关。(图1a)，2。在HKG，基因组、转录组和CDS的中值分

17、别为28.8、2.8和1.4千字节，在泰国南部为7.2、1.6和1.0千字节。(表1) 3。hkg的所有长度参数都明显长于TSG。此外，HKG的外显子数量(中位数为11)通常大于TSG(中位数为4)，这与以前基于微阵列数据的结果相矛盾。以前，人们认为HKG的内含子、非编码区和CDS比非HKG的短。06:29:21，29，4。表达水平与表达宽度呈正相关。(图1b)HKG和TSG的中值表达水平分别为91.4和1.3(每百万转录本)(表1)。5.表达水平与长度参数之间的负相关实际上是非线性的。尽管高表达基因很少很大，但低表达基因的基因长度显示出广泛的变化。因此，表达水平不是对基因长度的有意义的预测。甚至这种负相关在酵母、果蝇和植物中也不存在。这些物种的基因几乎比人类和脊椎动物的基因短一个数量级。因此，经济基因选择可能只对相对较大的基因起作用。06:29:21，30，6。总的来说，我们观察到促甲状腺激素的表达水平比HKG低且短。我们发现了许多中