DNA重组和基因转移.ppt

1、第七章 DNA重组和基因转移,第一节 目的基因与载体的连接,一、粘末端DNA片段的连接,（一）具有相同粘末端的DNA分子之间的连接,使用碱性磷酸酶处理载体DNA，去掉其5末端的磷酸基，以防质粒DNA的自身环化 。,（二）具有不同粘性末端的DNA分子之间的连接,用两种不同的限制性内切酶对载体和外源DNA进行切割后，在它们两端会产生非互补的突出端，经DNA连接酶连接后即产生定向重组体。,质粒载体的定向重组,二、平末端DNA片段的连接,1、直接用T4连接酶连接,2、同聚物加尾法,3、衔接物连接法,衔接物是指用化学方法合成的一段由1012个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸

2、片段。,三、载体与DNA片段酶切位点不匹配的连接,4、DNA接头连接法,接头的一端是齐平的，而另一端是某种内切酶的粘性末端，先利用齐平末端连接方法将它与平端的外源DNA连接起来，造成人工粘性末端，即可再与之互补的粘性末端的载体DNA相连接。,所谓载体与DNA片段酶切位点不匹配，指载体与待克隆的DNA片段上的酶切位点不相同，因而用一种或两种酶切制造不出可互补的粘性末端。,1、按照平末端连接方法加上接头。,2、将凹端变为平端,（1）使用Klenow酶在4种dNTP存在下，将3凹端完全补平。,（2）用S1核酸酶去除3突出末端产生平端DNA分子,3、使用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段部分补平

3、3凹端转变成粘端。,TCGA,AGCT,GATC,CTAG,载体经xhoI酶切形成：,外源基因用San3A酶切形成：,用Klenow酶部分补平二者的3 凹端，形成：,TCGA,AGCT,GATC,CTAG,CT,TC,AG,GA,这样，就可以实现有效重组。,3,3,3,3,5,5,5,5,四、cDNA与载体的连接,通过依次加入、连接合成的DNA接头进行cDNA克隆,第二节 重组DNA分子的筛选与鉴定,外源基因与载体连接后转化大肠杆菌可能的三种情况：,（1）,（2）,（3）,转化,E.coli,一、遗传检测法,（一）根据载体表型特征选择重组体分子,1、抗药性标记插入失活筛选法,例：pBR322,

4、如果外源基因插入到tetr基因内部，tetr抗性消失，表型为不抗四环素（tets）、而仍抗氨苄青霉素（ampr），这样的转化细胞在含有 amp的培养基仍可生长，但在含有四环素的培养基上不能再生长；反之，如果ampr基因由于外源基因插入其内部而失活，带有重组DNA分子的转化细胞在含有tet的培养基平板上生长，在含有 amp的培养基不能生长。,插入失活法筛选重组子,2、互补,例；pUC质粒,在LacZ的大肠杆菌中，在平板培养中，菌落是白色的。若在该细胞中引入pUC质粒，其上有LacZ，质粒和大肠杆菌DNA可实现互补，菌落呈蓝色。 如果在质粒的多克隆位点的某个酶切点上克隆了外源基因，则LacZ基因受

5、到破坏，便不能再和缺陷型受体菌中生成有活性的-半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。,（二）根据插入序列的表型特征选择重组体,进入受体细胞的重组DNA分子中的外源基因如果在宿主细胞中能实现功能表达，产生出有功能活性的基因产物，那么鉴定此种重组体最简便的方法就是表型特征的直接选择法。,二、物理检测法,1、凝胶电泳检测法,2、R-环法,在临近双链DNA变性温度下和高浓度（70%）的甲酰胺溶液中，即所谓的R-环条件下，双链的DNA-RNA分子要比双链的DNA-DNA分子更为稳定。因此，将RNA和DNA的混合物置于这种条件下，RNA便会同双链DNA分子中与之互补的序列退火形成稳定的 DNA-RNA杂交分子，而

6、另一条DNA链则成为单链状态。这种由单链DNA分支和双链DNA-RNA分支形成的“泡状”体，叫做R-环结构。,三、核酸杂交检测法,例：原位杂交筛选重组体菌落(或噬菌斑),四、免疫化学检测法,免疫化学检测法是利用抗体与抗原结合的高度特异性来鉴别基因的。如果某个重组克隆中的外源基因能够表达，在这个克隆中就存在着这个基因的特定蛋白，即可用特异性抗体来检测。常用的有标记抗体测定法和免疫沉淀测定法两种 。,转化菌落,影印平板,置于含氯仿饱合气体的容器,细菌裂解，抗原释放,覆盖吸附有未经标记的抗体的NC膜,形成抗原抗体复合物,将NC膜与I125标记的抗体温育,放射自显影,与母板对照，挑取所需的重组克隆,标

7、记抗体测定法的步骤：,用免疫化学法检测克隆在表达载体pUC8上的基因,五、DNA-蛋白质筛选法,六、转译筛选法,原理：,外源DNA,蛋白质,翻译,能与某一特定DNA序列结合,作为探针与克隆群体杂交,转译筛选法是通过体外转译的手段鉴定阳性克隆的方法，可分为杂交抑制转译和杂交选择转译两种方法。,1杂交抑制转译,要求：被研究的目的基因编码有丰富的mRNA 。,原理：,步骤：,转化菌落,提取重组DNA,与mRNA总杂交,形成DNA-RNA杂种分子,将总mRNA（包括DNA-RNA分子,提取出来,体外转译,蛋白电泳放射自显影 （1）,总mRNA,体外转译,蛋白电泳放射自显影 （2）,经对比，（1）比（2

8、）中少了一种蛋白质,找到一种转译作用被抑制了的mRNA,筛选出重组菌落（或噬菌斑）,2、杂交选择转译,观察到在这种杂交选择的转译中，存在着一种特殊活跃的mRNA。,重组体库,提取DNA,固定在NC膜上,与mRNA或总RNA杂交,目的基因与对应的mRNA杂交，mRNA固定在NC膜上,将分离mRNA的进行体外转译,凝胶电泳或生物活性检测,找出单菌落重组体,第三节 基因转移方法,一、重组DNA导入大肠杆菌,（一）转化,将外源DNA分子导入某一宿主细菌细胞的过程都叫转化。,为了有效地使细菌吸收外源的DNA分子，我们通常要对它们进行一些物理或化学的处理，处理后的细胞吸收外源DNA的能力大大提高，被称为感

9、受态细胞。,对于大肠杆菌细胞，一般采用50mmol/L的CaCl2溶液来制备感受态细胞。,（1）吸附阶段：完整的双链DNA分子吸附于感受态细胞表面。 （2）转入阶段：双链DNA分子解链，以单链形式进入细胞，而另一链则被降解。 （3）自身稳定阶段；外源质粒在细胞内又复制成双链环型DNA。 （4）表达阶段：即目的基因随质粒的复制子一起复制，并被转录、转译。,DNA分子转化的过程：,质粒DNA的大小及构型对转化效率的影响：,（1）大小 10Kb，转化效率很低 （2）构型 超螺旋环形线状,（二）转染,（2）噬菌体的体外包装,转染(transfection)：是指感受态的受体细胞捕获和表达以噬菌体为载体

10、的重组DNA分子的过程。,（1）转导和转染的区别,转导(transduction)：通过噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA转移到受体细胞的过程。 转染：噬菌体DNA分子直接导入受体细胞的过程。,体外包装：是指在体外模拟噬菌体DNA在受体细胞内的一系列特殊的包装反应过程，将重组噬菌体DNA分子包装成为成熟的具有感染能力的噬菌体颗粒的技术。,噬菌体的体外包装的原理：,根据噬菌体DNA的体内包装途径，分别获得缺失D包装蛋白的噬菌体突变株和缺失E包装蛋白的噬菌体突变株。由于不具备完整的包装蛋白，这两种突变株均不能单独包装噬菌体DNA，但将两种突变株分别感染大肠杆菌，从中提取缺失蛋白D的包

11、装物（含E蛋白）和缺失E蛋白的包装物（含D蛋白），两者混合后就能包装噬菌体DNA。,二、重组DNA导入植物细胞的方法,（一）载体介导的转化方法,1、共培养法(cocultivation),该方法是Marton等1979年以原生质体为受体建立起来的，随后经过一系列的改进，现在是植物基因工程中最常用的一种转化方法。该方法的主要原理是将受体与供体在一起培养，通过接触感染而发生转移，供体常用农杆菌、病毒载体等形式。,（1）原生质体共培养法,取含重组Ti质粒的农杆菌同刚刚长出细胞壁的原生质体作短暂的共培养，促使农杆菌和植物细胞之间发生遗传物质的转化。,从烟草无菌苗中分离原生质体，并预培养24小时。 原生

12、质体与农杆菌混合培养，原生质体浓度l05ml、农杆菌l07ml，20下保温32小时。 冲洗去游离的细菌，将原生质体培养在有抗生素(250mgL万古霉素，200mgL羧苄青霉素，200mgL链霉素)的培养基中，这些抗生素抑制细菌生长，而对原生质体无毒害。 3周后，离心收集细胞团，再培养在无激素培养基上，2周内，转化的细胞团是激素非依赖性生长细胞团，在该培养基中可快速生长，而非转化的细胞团则生长很慢，最后变褐死亡。,烟草原生质体与Ti质粒转移的共培养法程序为：,（2）叶盘共培养法,图,该方法最早由Horsch(1985)首创，用于烟草转化 。,优点：适用性广，对于那些能被农杆菌感染的、并能从叶子再

13、生植株的各种植物均适用。,（3）悬浮细胞或愈伤组织共培养,（4）活体接种(inoculation in vivo),原则上，该种共培养与原生质体共培养的方法和步骤是相同的，在供体上，则必须是有侵染和感染能力的载体系统，如带有Ti质粒的根癌农杆菌。,所谓整体植株接种转化法，是指人为地在整体植株上造成创伤部位，然后把农杆菌接种在创伤表面，或用针头把农杆菌注射到植物体内，使农杆菌按照天然的感染过 程在植物体内进行侵染，获得转化的植物愈伤组织或转基因植株。接种后2-3周，切下接种处部分组织培养4周，可产生愈伤组织，进一步通过分化培养可获得转基因植株。,2、病毒介导的基因转移,（1）双链DNA病毒转化载

14、体,这类病毒是以双链DNA作为遗传物质，在这类病毒中，目前研究的最多的是花椰菜花叶病毒（简称CaMV, Caullinus Mozic Virus）。,（2）单链DNA病毒转化载体,GeNV顾名思义，可翻译成“双联体病毒”或“孪生病毒”。GeNV的感染范围较广，包括单子叶和双子叶植物，它们的传播媒介是昆虫。,（3）单链RNA病毒转化载体,迄今为止，还没有建立起一个完善的以植物RNA病毒为基因载体的基因转化体系，但是RNA病毒仍是一个很有希望作为基因工程载体的植物病毒。,（二）DNA直接导入法,1、物理方法,（1）基因枪法,80年代末期，由康奈尔大学的Sanford最先提出，主要是为了克服以往各

15、种基因转化技术的局限。,该方法是利用一种物理仪器装置，将钨、金等金属微粒加速冲击细胞，把细胞击孔，使目的基因进入受体。,首先将钨、金微粒(直径约0.4m，重量约0.05mg)与供体DNA溶液(12l)混合并保温，使DNA吸附在金属微粒的表面，然后将该溶液置于所谓的“基因枪”仪器中，仪器高压放电将金属微粒加速，直接喷射受体原生质或细胞，细胞击穿成孔后，在钨粒上的DNA以及溶液中的DNA都可以进入受体细胞。,操作技术程序为：,基因枪示意图,基因枪所用材料： （1）钨粉使用起来经济实惠，也可以得到较好的转化效果；但容易被氧化，颗粒易聚集，并且对植物细胞的毒害也比金粉大。,（2）将DNA包被到微载体上

16、所用的试剂有亚精胺、CaCl2、乙醇、聚乙二醇、异丙醇等，但多用前两种。,（3）所用动力系统：一类以火药爆炸力作为动力加速微弹；另一类以电弧放电蒸发液滴作为动力；第三类以高压蒸汽作为动力。,基因枪法的特点：（1）转化效率高。,（2）受体广泛。,（3）操作简单。,（2）电激法(electroperation),电激法是利用高压电脉冲的作用对原生质体或细胞击出微孔而使基因转移的一种新方法。,原理：细胞生物学研究证明，细胞膜的磷脂双分子层可视为一种电容，其静膜电位（Vm）约为l00mV，导电性很差。当把细胞置于外加电场中时，会使膜电位升高，双分子层两端电压形成差势，随着外加电场电压升高，细胞膜被压缩

17、变薄，当膜电压升到一定数值时，膜被击穿。,可逆击穿：击穿小孔可在一定时间内复原。,不可逆击穿：击穿小孔不可修复，处理细胞成活率低。,操作程序：,将盛有细胞和DNA混合物的特制小容器置于电脉冲仪的正负极之间，在0度下加高压（2 4KV），电脉冲10分钟后，将待处理的细胞转移到新鲜培养基中生长2天，再进行筛选。存活细胞的回收率约为60% 80%。,（3）微注射法（micro-injection）,微量注射：用注射针或微针在受体细胞或组织穿刺成孔，DNA随穿刺孔进入细胞或随穿刺针头道进入。,真正的显微注射：利用显微注射仪，通过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核的基因转化方法。,显微注射技术的

18、关键是原生质体或具壁细胞或细胞团的固定。对于植物细胞而言，首先必须建立固定细胞技术，然后才能进行定位显微注射操作。常用的细胞固定方法有3种： 一、琼脂糖包埋法 二、多聚赖氨酸粘连法 三、吸管支持法,（4）激光微束法(laser microbeam),（5）超声波法,此方法是利用直径很小、能量很高的激光微束引起细胞膜可逆性穿孔的原理，在荧光显微镜下找出合适的细胞，然后用激光光源代替荧光光源，聚焦后发出激光微束脉冲，造成膜穿孔，处于细胞周围的外源DNA分子随之进入细胞。,基本原理：是利用低声强脉冲超声波的物理作用，击穿细胞膜造成通道，使外源DNA进入细胞。,利用超声波处理可避免脉冲高压对细胞的损伤

19、作用，有利于原生质体的存活，是一种有潜力的转化途径。,（6）离子束法,离了束作用在生物表面后可引起电子溅射，离子束的溅射好象一把手术刀，对生物体进行微细加工，使生物体表面层层剥离，原来不连通的通道在一定距离内连通，后来的离子就可穿行较长的距离，落在预定的位置上。,2化学方法,（1）PEG法,是细胞融合剂，它可以使细胞膜之间或DNA与膜之间形成分子桥，促使相互之间的接触和粘连；还可以引起膜表面电荷的紊乱，干扰细胞间的识别，从而有利于细胞膜之间的融合和外源DNA进入原生质体。,(2)脂质体法,脂质体是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜结构，可将DNA包在其内，并通过脂质体与原生质体的融合或由于原生质体的吞噬过程，把外源DNA转运到细胞内。,早期：丝氨酸磷酸+胆固醇 第二代：二油酰乙醇胺磷脂+胆固醇+软脂酸,3、种质系统法(germ line transformation system),（1）花粉管通道法（pollen-tube pathway）,在显花植物中利用花粉在柱头上萌发进入胚囊所留下的通道，将外源基因渗入到胚囊中的基因直接转移方法。,（1）受体是整株水平，无须离体培养，突破了宿主范围的限制，可应用于任何开花植物。 （2）转化可用于重组DNA，甚至是总DNA。 （3）操作技术条件宽容。 （4）转化率高。,优点：,（2）浸渍法,该