基因工程的基本操作程序.ppt

1、基因工程的基本操作程序,1、原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录,不能编码蛋白质的区段,：能编码蛋白质的区段,连续不间断,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,有调控遗传信息表达的核 苷酸序列.包括启动子和终 止子,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,启动子,终止子,2、真核细胞的基因结构,编码区,与RNA聚

2、合酶 结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点（启动子）。,非编码序列 =,非编码区 + 内含子,3、原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,信使RNA的加工：,成熟的信使RNA,转录,加工,初级转录物,剪切内含子转录部分

3、拼接外显子转录部分,真核生物基因转录后的剪切、拼接和转移等过程，都需要有调控序列的调控，这是真核生物所特有的。,编码区,基因表达的计算,在真核生物中，对应的是 的碱基数,631,氨基酸数,碱基数,？,补充资料,基因中外显子,1.2 基因工程的基本操作程序,基因工程基本操作的四个步骤,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,一、目的基因的获取,1）、从基因文库中获取：适用目的序列未知情况,2）、利用PCR技术扩增：适用于目的基因核酸序列已知,3）、人工合成：适用目的基因不是很大且序列已知的,1、目的基因：是人们所需要转移或改造的基因，它是

4、编码某种蛋白质的结构基因。 获取目的基因是实施基因工程的第一步 。,2、获取目的基因的常用方法,（一）、从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,1、基因文库,基因组文库的构建,2、基因文库的构建方法,通过对受体菌的培养而储存基因, cDNA文库的构建-反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,目的基因的mRNA,单链DNA,逆转录酶,DNA聚合酶,双链DNA (目的基因),基因组文库和部分基因文库的比较,小

5、,大,无,有,无,有,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可以,部分基因可以,依据：目的基因的有关信息。 如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性,从基因文库中得到目的基因的方法,（二）利用PCR技术扩增目的基因,1、PCR的含义多聚酶链式反应的缩写 是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。,2、原理： 3、前提： 4、原料 5、方式,PCR扩增仪,DNA双链复制,一段已知目的基因的核苷酸序列，以合成引物,以_方式扩增， 即_（n为扩增循环的次数）,指数,2n,模板DNA；DNA引

6、物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；离子,6、过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，解旋形成_,b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下， 合成与模板互补的_,氢键,单链DNA,双链,DNA链,变性、退火、延伸三步曲,（三）、人工合成法：,基因较小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成仪人工合成,7、结果：,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,2.基因文库的构建方法,（1） 鸟枪法 （2） 反转录法 （3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法,人工合成法,（真核生物

7、）,多用于原核生物,直接分离法,二、基因表达载体的构建 基因工程的核心,1、目的：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,2、基因表达载体的组成：,复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因,它们各自的作用是什么?,启动子：是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质 终止子：能终止mRNA的转录 标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来,载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构

8、 用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键 启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。,注意,（1）用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。 （2）用_ 切断目的基因，使其产生_。,（3将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,相同的黏性末端,切口,DNA连接酶,4、过程:,质粒,DNA分子,限制酶处理,一个切口 两个黏性末端,两个切口 获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组

9、质粒）,同一种,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,三、将目的基因导入受体细胞,（一）转化：,（二）方法,将目的基因导入 植物细胞,将目的基因导入 动物细胞,将目的基因导入 微生物细胞,农杆菌转化法（主要）,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,Ca2+处理法,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,1、将目的基因导入植物细胞,（1）受体细胞：体细胞或受精卵,（2）方法：,(1)农杆菌转化法,特点:,能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力,Ti质粒

10、的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体的DNA上,转化过程:,Ti质粒 目的基因,构建,表达载体,植物细胞,植物细胞染色DNA,新性状,农杆菌,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,（2）基因枪法,适用于单子叶植物,（3）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,适用于被子植物,2、将目的基因导入动物细胞,受体细胞：,受精卵（全能性高）

11、,方法：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）,程序：,3、将目的基因导入微生物细胞, 常用法：Ca2+处理, 常用菌：大肠杆菌, 微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少, 过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,（用Ca2处理，增加细菌细胞壁的通透性）,四、目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,（一）、检测,1、导入检测：利用标记基因的特性,2、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,.首先取出转基因生物的基因组DNA .用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针 .使探针和转基因

12、生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中,（1）方法:,DNA分子杂交,（2）过程:,（二）、鉴定（个体生物学水平）,3、检测目的基因是否转录出了mRNA,4、检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法:,DNA分子杂交,方法:,抗原抗体杂交,过程: 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA,检测,导入检测：目的基因是否导入受体细胞,方法,利用标记基因的特性,表达检测,转录检测DNA分子杂交,翻译检测抗原抗体杂交,分子检测法,鉴定,抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等,个体水平的鉴定,插入检测：目的基因是否插入受

13、体细胞DNA上,方法：DNA分子杂交,思考与探究：,2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?,要选择合适的农杆菌 要加趋化和诱导的物质 加入酚类物质,3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,糖蛋白是蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。,4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？,（1）从小鼠中克隆出-珠蛋白