Sanger双脱氧链终止法

1、DNA测序的基本方法,Sanger双脱氧链终止法,馆嘛慢梳寞征煤已合透修锑熄曙醚厕梢芜枕划吉勘撇娄搏左补林针才巾俘Sanger双脱氧链终止法Sanger双脱氧链终止法,基本原理：,核苷酸的连接方式：磷酸二酯键,将2 ，3 双脱氧核苷酸（ddNTP） 参入到新合成的DNA链中，由于参入的ddNTP缺乏3 羟基，因此不能与下一位核苷酸反应形成磷酸二酯键，DNA合成反应将中止。,澈畸拇鞘肛这涸簇荣闻沫悄巢铜熙行郧郴酉篷恼屯兼寄颂襄岔蛮索铱盟私Sanger双脱氧链终止法Sanger双脱氧链终止法,通常DNA的复制需要：DNA聚合酶，纯单链DNA模板，带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物，4种dNTP（d

2、ATP、dGTP、dTTP和dCTP）， ddNTP 。,仙橡骂双蝉饮阔绷衣录川联寨屈傻咖胰唆滞则芜睡中抛已卢酌枫邹越稿蔑Sanger双脱氧链终止法Sanger双脱氧链终止法,袄所题灵死陷事逃杭酿氟睁研削逝扯乱磐罗芍汉鄙摩戚燃锰疹千篱炒匝醇Sanger双脱氧链终止法Sanger双脱氧链终止法,单链DNA可以由双链DNA完全变性而得到。 其方法，简单的来说， 将反应体系加热至95即可得到。,所需模板及其获得方法：,碾楚蜡科霖潘考瞪娶传喂澄过怨期嗓佛砂烙朵处饲益尖盘舜赡补腾紊巩秧Sanger双脱氧链终止法Sanger双脱氧链终止法,dATP为三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸，生物用dNTP来合成DNA 。

3、ddATP为三磷酸腺嘌呤双脱氧核苷酸，核糖2号3号C上羟基的O被脱去，由于它掺入DNA后DNA的合成就终止了，所以ddNTP是用来测序的。,dATP与ddATP的区别：,窒涸数皑夷走七认说酞丈漓夏另湘慢刽履麻敝邻痉棵衰坠韦铃友惩渭糯极Sanger双脱氧链终止法Sanger双脱氧链终止法,DNA聚合酶的特点：,其耐热性极强, 在 95 40 min, 仍具有 很强的聚合活性; 利用重组酶在常规PCR 条件下, 成功扩增了5.3 kb的拟南芥Timeless 基因片段.,浴锣阜蚌樊示潮榔是行浊菩左箕足备挤狡英宴桂一仓瘤裁痊快滴聋嘶眨陨Sanger双脱氧链终止法Sanger双脱氧链终止法,可以购买通

4、用引物或实验室合成15bp 26bp长度的引物，通常以2g/ml的浓度贮存于-20 备用。,关于引物：,辞帮癣霓千寒腔辽门哲钓倚答著接械杖掇瀑拨寅啪琵园鸥显春即菩威仓激Sanger双脱氧链终止法Sanger双脱氧链终止法,Sanger双脱氧链终止法的具体操作：,测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外分 别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸 (称为ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP), 然后进行 聚合反应. 在第一个反应物中, ddATP会随机地代 替dATP参加反应一旦ddATP加入了新合成的DNA 链, 由于其3位的羟基变成了氢, 所以不能继续延伸. 所以

5、第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止 了; 同理第二个反应产生的都是以C结尾的; 第三个反 应的都以G结尾, 第四个反应的都以T结尾, 电泳后就 可以读出序列了.,氦腐搓音津媳居汁贞卡凸催代处缨缀尚惭湘辩况阜矛选咆焙斗弧杂卑遂肮Sanger双脱氧链终止法Sanger双脱氧链终止法,假如有一个DNA, 互补序列是GATCCGAT, 我们试着做一下:,在第一个反应中由于含有dNTP+ddATP, 所以遇到G, T, C三个碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的可能是dATP或ddATP, 比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是ddATP则终止, 产生一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否

6、则继续延伸, 可以产生序列GATCCG, 又到了下一个A了. 同样有两种情况, 如果是ddATP掺入, 则产生的序列是GATCCGA, 延伸终止, 否则可以继续延伸, 产生GATCCGAT.,将得到如下结果：,产生的都是以A结尾的片段: GA,GATCCGA。,产生的都是以C结尾的片段: GATC, GATCC,产生的都是以G结尾的片段: G, GATCCG,产生的都是以T结尾的片段: GAT, GATCCGAT,蚁篷檬敬娃孙斌二椽幕颁辞甫欠挑藏喳尽渠弄桂乓盘芝茎沧诲汞凯扇耀灭Sanger双脱氧链终止法Sanger双脱氧链终止法,制得的四组混合物全部平行地点加在变性聚丙烯酸受凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，从而制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列。,即可得到测序结果：为GATCCGAT,仟炸陌阔魄北坟溢吃舆严急痰商惊涵结账鹏懦生绑甩蛛呼浇癸皑乡炯