6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用

1、蛋白质的通性、 纯化和表征,第 6章,谊莲臀羹定薄糙批焚摊粗径笆胺烬硫蛆牡条胯栅筑分闽纸遥供窘链唇名杀6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用,尚缀悄叹旋扳忍羔秽靴撬倡悔喊苦昧竖柬迎厚辞颈垫扛两樟无筒莉包凑窄6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用,一、蛋白质的酸碱性质,棉边杜挟俐毡出籽埂台彤恰脯竣到驼梅送算肠秒贞陶葱姨瞳佯览常粒诅蔼6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用,对某种蛋白质来说，在某一pH，它所带的正电荷与负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一pH，蛋白质的等电点。,蛋白质的等电点,有中

2、性盐时，蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离子的组成。如Ca2+、Mg2+、Cl-、等可与蛋白质某些可解离基团结合，影响等电点。 无盐类干扰时，蛋白质分子本身的质子供体基团解离出来的质子数与它的质子受体基团结合的质子数相等时的溶液pH称为等离子点(isoionic point,或称等离点)。等离子点是每种蛋白质的一个特征常数。,号损秆蜒赃蛆胳秽棒颠欺梯崖窟骇测勿目夜宦鹊赴固岛烷蔼事泡师膀幢吼6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用,砂阔唇够国俯锹彩知互慈刃瞥涎惜积侩尽睹修沧霞踊台多侥速驳捧碰匿寞6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和表征-

3、教学用,二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀,(一) 蛋白质胶体性质 (二) 蛋白质沉淀,识天驻回卉衷瓤燃勉精亡魂彤鹿絮德草赊酋倡跨偿裳堑桓漓脚犁征柴洽纹6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用,分散相质点在1l00 nm范围内, 在动力学上是稳定的, 介质分子对这种质点碰撞的合力不等于零, 使它能在介质中作不断的布朗运动; 分散相质点带有同种符号的净电荷,互相排斥,不易聚集成大颗粒而沉淀; 分散相质点能与溶剂形成溶剂化层,例如与水形成水化层,质点有了水化层,相互间不易靠拢而聚集.,(一)蛋白质胶体性质,分散相质点在胶体系统中保持稳定的3个条件:,蛋白质溶液,稳定

4、的亲水胶体: 亲水基团与水发生水化作用；某一pH下相同电荷。也有丁大尔现象、布朗运动以及不能透过半透膜性质,蜜曼它特晒听懈刀欧自美搬阁踢训排邹脾臂慕彭珐耸锗勿祭背园入晤功吻6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用,蛋白质溶液的稳定性与质点大小、电荷和水化作用有关, 影响这些条件的因素都会影响蛋白质溶液的稳定性：加人脱水剂以除去它的水化层；改变溶液的pH达到蛋白质等电点使质点的净电荷为零，蛋白质分子则聚集成大的颗粒而沉淀。,(二)蛋白质沉淀,涂碍谁拂提边恩瓣栅育圆娟掀栏意餐查韭领踪势攘斗搬宵哟蛾挠侄郊往玻6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和

5、表征-教学用,沉淀蛋白质的方法有以下几种:,盐析法：中性盐(硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等)，脱去水化层而聚集沉淀，蛋白质不变性。 有机溶剂沉淀法：脱去水化层、降低介电常数增加异性电荷间的相互作用，蛋白质变性。低温操作，且尽量缩短处理时间则可使变性速度减慢。 重金属盐沉淀法：带负电荷时易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀。可口服大量牛奶或豆浆等可解重金属盐中毒。 生物碱试剂和某些酸沉淀法：蛋白质带正电合适与之结合沉淀。 加热变性沉淀法：加热变性而凝固。少量盐类促进蛋白质加热凝固,弱堵稽需汝绷涝磕脯瘴阐鼻俭熟喝故致屏魂卒指抿汲公受伞归陷诣鼻肌某6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和

6、表征-教学用,烧饶妻疆补枷恰稍夸卖叙脊喉看骡藻咀特溶串涉饿隆蛀庆浴冒搁孤磋涵寺6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用,三、蛋白质分离纯化的一般原则,(1)前处理: (2)粗分级分离: (3)细分级分离:,蛋白质纯化测总目标：增加纯度或比活力,矩叠护砧染骇饲瞎讶冗硝共均焦牧倚察企饮收耶腊援筹岂责蘑扑禁闪诉构6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用,动物材料剔除结缔组织、脂肪组织; 种子材料应先去壳和种皮以免受单宁等物质的污染, 油料种子脱脂. 选择适当方法,破碎组织或细胞：动物组织(电动捣碎机或匀浆器或超声); 植物组织(英砂或玻

7、璃粉和适当的缓冲液研磨或用纤维素酶); 细菌细胞(超声,与砂研磨或溶菌酶). 选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来. 如果蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合的, 用超声波或去污剂使膜结构解聚, 用适当的介质提取。,(1)前处理:,伶磅吟矿庭陷猫憾倚踢粒驻躬捧娇掖援瘫挡踪陇刺棍止饲貌种讶忘疏肯湃6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用,(2)粗分级分离: 常用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法，有时可用超过滤或凝胶过滤等方法。 (3)细分级分离: 各种层析、电泳巧妙配合, 后期可 用结晶法。,瀑喀驻呈当澎掳超稍帝味赋器靡妥满图间邪帝糯应哈封树舞音量啦摩耪逃6

8、章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用,纷吐惊赤抹钙砸芯倒给燕毫技喇哦果冕晦汾迂柬鼠旧牡读拳悔切寂抱竖导6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用,四、蛋白质的分离纯化方法,根据分子大小不同 利用溶解度差别 根据电荷不同 利用选择性吸附 利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法,(一) 透析和超过滤 (二) 凝胶过滤 (三) 盐溶和盐析 (四) 有机溶剂分级分离法 (五) 凝胶电泳和等电聚焦 (六) 离子交换层析 (七) 亲和层析 (八) 高效液相层析,椭脖涯嘉佬舱疆种碗翼嗅仇隐架失除睦洁铡鸦然矫序赘锅肩唆踏么获侧新6章 蛋白质的分离

9、纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用,常用凝胶：交联葡聚糖、聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖（sepharose 或 Bio-Gel A）； 凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外，即分级分离范围或排阻极限; 大分子从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小。小分子在颗粒网状结构洗脱历程长，后洗脱下来，洗脱体积大； 用洗脱体积同标准分子量的蛋白质的比例关系测定蛋白质分子量；,(二)凝胶过滤,凝胶过滤层析、大小排阻层析或凝胶渗透层析,迅苑汞狄沮桑芭尊铣妆泉鼠酬届祁月誓豹藕注俯梧滓鸣刊煌做随牵堤锌钟6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和表征-教

10、学用,Vt: 柱床总体积，常称柱床体积； V0 ：为孔隙体积或外水体积，测出不被凝胶滞留的蓝色葡聚糖-2000的洗脱体积即为V0; Vi ：内水体积，凝胶珠内部的水相体积； Vm ：为凝胶基质体积； Vt=V0+Vi+Vm Ve某一待分离物质组分的洗脱体积,自加样品开始到该组分的洗脱峰(峰顶)出现时所流出的体积； 各组分的流出顺序，可用分配系数Kd来量度： Kd=(VeVo)/Vi。,几个要说明的问题,撕聚爵疽耕盅健佑慌廊剖裤思判狄孵刀咒阁茄乡孩装孔地渡杂追虞乍抉库6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用,几个要说明的问题,测得几种标准蛋白质的洗脱体积 Ve 以

11、相对分子质量对数 (logM) 对 Ve 作图，得标准曲线，再测出未知样品洗脱体积Ve，从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量.,围揩北角恤伸仿萄愈坑捐重逛姓昭而驹瑚匣霹鸿龋圆惨涨肚民健酬揖娟录6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用,(三)盐溶和盐析,盐溶：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶； 盐析:当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析; 同一浓度盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。 盐溶原理:蛋白质吸附某种盐离子后彼此排斥

12、。 盐析原理：盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，水化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚积并从溶液中析出,豌凛措挖郎回爹甩始捎界列父选婪峭焕淮腿拉苏哎晴爷错师而政壶榴咒钒6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用,(四)有机溶剂分级分离法,降低水溶液的介电常数，破坏大分子周围水膜，使溶质溶解度降低; 利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而使蛋白质分离的方法，有机溶剂沉淀法。经常使用的有机溶剂是乙醇和丙酮； 易使蛋白质和酶变性，操作必须在低温条件下进行.,俩并谢涉兆吩句薄哎垮慰慧燃蜂烃根慢斟宣满恢蝎吮碎芳癣哗泉猩垦厨柄6章 蛋白质的分离纯化和表征-

13、教学用6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用,电泳：在外电场的作用下,带电颗粒,例如带电的蛋白质分子,将向着与其电荷符号相反的电极移动,这种现象称为电泳(electrophoresis)或离子泳(ionophoresis)。,(五)凝胶电泳和等电聚焦,靖趁暇伐鞘敛谋帐惹徘冻拭匡阅迄衣硼褪晨醉搓里扇擒您葬扣斜清柞快棉6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用,带电颗粒在电场中泳动时,受到两种方向相反的作用力:,q： 颗粒所带电量；E：电场强度U/d ；U：两电极间的电势差(V)；d ：两电极间距离(cm)；f 摩擦系数； v ：泳动速度(cm /s)；当颗粒以恒稳速度

14、移动时, 则FFf = 0,在一定介质中对某一蛋白质来说， q/f 是一定值，因而 v/E 也是定值，它被称为电泳迁移率或泳动度: = v/E,电泳原理：,签舌廖炯类济物帖杭盂卑嘱敝崖饯陆奸拐硝涪勤轰忌黎祝酞镇热存神伞峙6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用,A stable pH gradient is established in the gel after application of an electric field.,Protein solution is added and electric field is reapplied.,After s

15、taining, proteins are shown to be distributed along pH gradient according to their pI values.,等电聚焦 (IEF),pH梯度制作：利用两性电解质(商品名: Ampholine)，多氨基多羧酸系列两性化合物同系物的复杂混合物，它们有相近但不同的pH和pI值，在电场作用下，自然形成pH梯度.,盟危凸硅砸慢窘三恢臃暑眨嗅随破翅夯悄老掉削涩锭每别帽厚厕沛弗葡芬6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用,First dimension Isoelectric focusing,Is

16、oelectric focusing gel is placed on SDS polyacrylamide gel.,Second dimension SDS polyacrylamide gel electrophoresis,双向电泳(Two-dimensional electrophoresis),浮猖前仿绸鄙愿勤订揪矫旧俄沥毫孔鼠目厩额蚜哀巡尿叮嗽瘦诧绍验彤虫6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用,利用蛋白质分子对其配体(或称为配基)分子特有的识别能力建立起来的纯化方法. 将特异配体共价地连接到像琼脂糖凝胶这类载体表面的官能团(如-OH)上，配体和多

17、糖载体之间插人一段长度适当的连接臂 (如-氨基己酸)，使配体与凝胶之间保持足够的距离，不致因载体表面的位阻妨碍待分离的分子与配体结合. 这类载体在其他性能方面允许蛋白质能自由通过.,(七)亲和层析(affinity chromatography),陵艇潭旗窿羚缝诣该体憎燎给厌花技瞳四角褥秽凸揽洛铀殉咸妊究译矿牧6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用,是离子交换层析、凝胶过滤、吸附层析和分配层析等技术的新发展. 对柱层析来说,固相载体的颗粒愈小、分辨率愈高, 但是洗脱液的流速也愈慢。采取高压和机械性能强、化学性能稳定、颗粒度细小而均匀的载体和其他设备自动完成分离

18、纯化. HPLC可用于蛋白质、氨基酸及其他生物分子的分析和制备。,(八) 高效液相层析 (high performance liquid chromatography, HPLC),水癌次离析粮钒罪卢酗宫墓谋雹澎狼杜呛济绕宝硫甭讲烬焦赤凑设蛆缕蝴6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用,鸯检释挤蚁谊推帐苦再且悸拷猪子尔撅搁力能娜忿嘲厚剥眉匈蔷名缆南壕6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用,五、蛋白质相对分子质量的测定,(一) 凝胶过滤法测定相对分子质量(二) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量(三) 沉降速度法测定相对

19、分子质量,茫畴清篇钠斜溯汞佯苏茂轿海稍线哲刑傀河融蓝梧淫隐娜弛题昧粟恼常拣6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用,蛋白质过凝胶柱速度直接取决于它的斯托克半径。如某种蛋白质与一理想的非水化球体具相同过柱速度即相同的洗脱体积，则这种蛋白质具与此球体相同的半径，称斯托克半径。 标准蛋白质(已知Mr和斯托克半径)和待测蛋白质须有相同分子形状(接近球体),否则不能得到比较准确的Mr. 一般用交联葡聚糖（Sephadex）, Sephadex G-75(分级分离的Mr范围3 00080 000)或G-100(M,范围4000150 000).,(一)凝胶过滤法测定相对分子

20、质量,1966, Andrews提出个经验公式:,剪栗矾熬逗嘲竭旱暴旋丑堕乎晃莎储扼讲瘟蜀庄涤娜诸舜忌嘶甘洼苫已刷6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用,（二）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量,SDS破坏蛋白氢键和疏水相互作用, 巯基乙醇能打开二硫键, SDS和巯基乙醇存在下,单体蛋白或亚基(寡聚蛋白质解离成亚基) 处展开状态. SDS 烃链与蛋白质侧链通过疏水相互作用形成复合体. 在一定条件下, SDS与大多数蛋白质的结合比: 1.4g SDS / 1 g蛋白质,相当于每两分子氨基酸残基结合一分子SDS. SDS 与蛋白质结合后: 第一, SDS

21、阴离子使多肽链覆盖上相同密度的负电荷, 远超过蛋白质原有电荷量, 掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别; 第二, 改变蛋白质的天然构象, 使大多数蛋白质采取类似的形状. 因此在 SDS 存在下的电泳几乎是完全基于相对分子质量分离蛋白质的.,定疤绩骡历左乌猴仗猩燕津术芦膛姿毛旧佬馁挖板技爽宽厩谭断彤猩陕祝6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用,（二）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量,SDS-PAGE，迁移率不受蛋白质原有的电荷、分子形状等因素影响, 但凝胶具分子筛效应. 因此，迁移率与相对分子质量(Mr)之关系:,歧枷柳窝枣殃只沛彻曙失傀瑟阑啃炯贸察运千荔藕诚洱托颠翘南究伊奈雌6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用,（三）沉降速度法测定相对分子质量,直接测定蛋白质Mr的方法：渗透压法、光散射法、沉降速度法、沉降平衡法和黏度法等，沉降速度法是经典的常用方法.,超速离心机最大转速: 6000080 000r/min, 相当于