酶的高通量筛选.ppt

1、酶的高通量筛选和定向筛选报告员：黄剑宇导师：枚卫，生物催化剂介绍，生物催化剂和转化是以细胞或酶为催化剂进行物质转化，大批量生产化学物质、医药、能量、材料的科学。 优点：一种生物催化剂能催化一系列基质或许多非天然基质的酶具有高选择性，特别是具有化学催化剂无法模仿立体和区域选择的优势的生物催化反应，通常反应条件温和，环保。 缺点：目的介质中生物催化剂的不稳定性导致的活性下降或完全丧失生物催化剂可以催化我们所知的各种反应，但对特定的基质和产物可选择的酶通常很少，而且目前只有极少数的酶可商业获得。 从酶的发现到生产应用通常是一个困难的漫长过程。 实际应用取决于与传统工业过程的竞争，只有在竞争中取得明显

2、的经济优势，生产应用、生物催化研究过程、酶的筛选、酶的筛选分为选择培养基筛选法和检测培养基筛选法。 选择培养基的筛选法通过添加或减少某种成分使目标菌株得到生长优势，但其他菌株的生长受到抑制，通过多次筛选分离最终得到目标菌株。 单碳源的选择性培养基，可以利用反应基质的微生物得到生长优势而大量繁殖，不能利用反应基质的微生物由于得不到营养生长而受到抑制，得不到所需的目标菌株。 互补方法是筛选在有营养缺陷的培养基中可合成该营养物质的菌株。 培养基筛选法通常通过在培养基中加入某种试剂或化学药品，培养后引起培养基的透明度的变化或菌落周围颜色的变化等某种可识别的变化，从而区别不同种类或生理特性的微生物。 这

3、种筛选可以用检测平板进行，也可以用细孔滴定板进行，可以容易地用一部分检测器实现高通量的筛选。 采用酶的高通量筛选比色法和荧光检测的高通量筛选、检测培养基筛选法，显色基团或荧光基团参与基质的催化反应最易实现高通量筛选。 通过监测反应过程中颜色和荧光的变化，可以有效地监测反应的进行。 通过使用比色校正和荧光校正检测显色和荧光基质，pH指示剂的显色反应和荧光共振能量转移也能够以高吞吐量实时检测。 基于比色法和荧光测定的高通量筛选显色或荧光基质的高通量筛选，大部分荧光和显色基质都具有高酸度的苯酚或苯胺脱除基，目前广泛应用的是以硝基苯和蘑菇衍生物为基质的该技术检测但是，这样的基质通常不稳定，反应特异性差

4、，反应速度快，比普通的基质高几位数，不适用于难以转化就难以合成的反应和粗酶催化剂的反应以及一些条件激烈的反应，例如高温、高pH值等。 在比色法和荧光测定的高通量筛选pH指示剂显色高通量筛选的基础上，许多水解反应伴有pH的变化，根据反应介质和反应平衡常数选择合适的pH指示剂可以准确测定水解反应速度。 pH指示剂的显色技术广泛应用于腈水解酶和酯水解酶等水解酶的筛选Quick E法，根据pH指示剂的显色反应相互监测对映体基质的水解速度，根据水解速度的不同评价酶的立体选择性。 该技术最近用于荧光假单胞菌酯酶定向进化中突变体的筛选，得到了立体选择性明显提高的突变体。该方法可以扩展用于生物多聚体的组成动力

5、学、DNA限制酶切反应、DNA发夹结构的脱折叠等研究。 最近该技术被用于检测核糖核酸酶的反应活性。 基于反应热力学变化红外检测的高通量筛选，所有物质都可以发出红外光，光电面聚焦阵列红外检测器可以灵敏地检测反应中的热变化(检测波长范围3-5m，温度变化10-100mK )。 发热反应在红外成像中表示“热”点，相反吸热反应表示“冷”点，通过识别“热”点或“冷”点，能够检测反应有无进行。 红外检测技术是一种新的有前途的高通量筛选技术，不需要添加显色基和荧光基，避免了比色和荧光检测方法的局限，但该技术尚未定量，只能检测催化活性高的酶，酶活性的进一步研究必须利用传统方法，方法本身需要进一步的发展和采用复

6、杂仪器设备的高通量筛选、高效液相色谱、质谱和毛细管电泳也用于检测反应速度，但作为高通量筛选技术，这些方法测试成本高，且一天只检测数百个样品方法的使用在一定限制下用放射性同位素标记基质进行脂肪酶筛选可获得较好的实验结果，该方法敏锐准确，但由于放射性同位素标记基质的使用受到限制，不能普及。 以酶的筛选、比色和荧光检测为代表的高通量筛选方法得到广泛应用，是目前酶高通量筛选的主要研究和发展方向。 随着生物催化剂在精细化工和医药行业的广泛应用，对手性纯化合物的大量需求使手性酶的筛选成为当前的研究热点，同时产品价值的提高也使许多复杂仪器设备进行高成本检测的方法成为可能，并逐渐获得许多应用。 酶分子的定向进

7、化，以上方法从自然界筛选的酶通常不能满足工业应用的需要。 主要限制因素有酶对非天然基质的惰性、工业应用环境中的不稳定性和低耐受性、非水环境中的低活力、对辅酶的依赖等。 酶分子的定向进化、定点突变等基因改造技术，改变蛋白质序列中的个别氨基酸残基，可以改造酶的性质及其催化特性，产生符合特定需求的酶，这种蛋白质工程技术又称为分子进化的合理修订。 用随机基因突变或基因重组技术结合定向突变体筛选方法的分子进化技术称为定向进化。 该技术避免了人们研究酶结构效应关系的难题，成功地改善了酶的催化特性，如酶的稳定性、基质特异性、立体选择性等酶的催化能力和新的代谢途径工程。 酶分子的定向进化、定向进化是由突变体库

8、的构建、突变体的表达、表达后筛选三个步骤组成的循环递归过程，(1)需要生成含有大量微量有利突变体的文库，(2)突变体可在适当的微生物(例如大肠杆菌或酵母菌)体内进行功能表达酶分子定向进化半理性文库semi-rational或简洁文库smart libraries的技术、构建变异体文库的方法包括以PCR和同源基因重组(DNA shuffling )为代表的各种基因变异和基因重组技术。 突变体库的多样性和冗馀性，基于对酶的结构效应关系的研究，发展了构建半理性库或简洁库的技术。 随机插入/去除技术半理性外显子重组技术合成重组技术计算机辅助设置修订技术、酶分子定向进化(归纳)、定向进化不仅是酶分子改造

9、的好工具，也是探索和研究酶蛋白质结构效应关系的好工具。随着各种基因技术的应用和发展，建立含有大量微量有利突变体的文库已不再是技术难题，目前的主要研究方向是构建更有效的突变技术和更简洁的突变体库的技术。 突变体筛选技术仍然是主要技术瓶颈，除了继续发展本文介绍的各种结合酶催化功能的高通量筛选技术外，还将进一步完善结合各种重组表达技术的蛋白筛选技术和蛋白展示库技术。 特别是筛选没有明显表型的突变体需要更多的研究和重视。 目的基因、基因突变技术、丰富的变种DNA文库、高通量筛选技术、高效生物催化剂、循环、生物催化剂的定向进化、酶的高通量筛选和定向进化、正向突变、高通量筛选技术、 人们对经济生产方式的追

10、求，对能源和环境的重视，特别是对医药和精细化工产品日益增加的巨大需求，进一步推动了生物催化剂在各领域的广泛应用和迅速发展。参考文献、10 Beisson F、Tiss A、Rivire C、 vergerr : methodsforlipasedetectionandassay : a关键审查. eurjlipid 133-153.acomprehensiveanddetailedreviewaboutalllll licesterhydrolysis11beissonf、第n个安全v、 vergerr : useofnaturallyfluorescenttriacylglycerolsfr

11、omparinariglaberrimumtodetectlowlipaseactivitiesfromarabidopsisthaliana 4033602313-2321.12kleing， reymondj-l : enantioselectivefluorogenicassayofacetatehydrolysisfordetectinglipasecatalyticantibodies.helvchimacta 1990 823330 r、Jourdain N、reymondj-l : fluorogenicpolypropionatefragmentsfordetectingste

12、reoselectivealdolases.chemeurj 2000、633604154 - Lerner ra : cnatlacadsciusa 110 95:15351-15330 millersj : achemosensor-basedapproachtocatalystdiscoveryinsolutionandonsolidsupport.jamchemsoc 1999。 12133604306-4307.16 .摩尔斯- v

13、arasf、沙阿、艾肯斯j、奈克拉尼诺、罗兹泽尔JD， demirjiandc 3360可视化ofenzyme-catalyzedreactionsusingphindicators 3360 rapidscreeningofhydrolaselibrariesandestimation a dchem1999、733602183-2188.17 .简历、温达交流， kazlauskasrj : quantitativescreeningofhydrolaselibrariesusingphindicators 3360 identifyingactiveandenantioselective

14、hydrolasess 433602325-2331.18 bornscheuerut 3360 methodstoincreaseenantioselectivityoflipasesandesterases.curropinbio 1:543-547.19 Jens famulokm :实时机械化ofribozymesbyfluorescenceresonanceenergytransfer (fret ).angewchemintedengl 110 3833601300 Schaefer DJ、Powers TS、Turner HW、Weinberg wh (1999 )组合实用程序兼

15、容性catalysis.angewcheminted 3833602494253221 reee 北美第二代航空母舰(2000 a ) IR-thermographicscreeningofthermoneutralorendothermictransformations : the ring-closingolefinmetathesisreaction.arcti on 1230 Schmidt H-W、梅尔瓦夫(1998年) detectionofcatalyticactivityincombinatoriallibrariesofheterogeneouscatalystsbyirthermography.angewcheminted 3736026442647，es h