生物光子学6生物光子学中的光谱分析技术01.ppt

1、主讲人：刘立新 西安电子科技大学,生物光子学,第 6 章,生物光子学中的光谱分析技术,2,6.1 吸收光谱技术 6.2 荧光光谱技术 6.3 拉曼光谱技术,本 章 内 容,3,6.1 吸收光谱技术,6.1.1 光波的分类 6.1.2 紫外可见吸光光度法 6.1.3 紫外可见分光光度计 6.1.4 吸收光谱技术在生物医学领域的应用,4,6.1.1 光波的分类 根据光的波长不同：紫外区、可见光区和红外区等。,各类电磁辐射的波长范围 辐射类型波长 （nm） 无线电波1012109 微 波109106 红外线： 远红外1063103 中红外31043103 近红外3104770 可见光770390 紫

2、外线39010 X射线10102 射线102105,6.1 吸收光谱技术,5,1、基本原理:光的选择性吸收,分子中的某些基团吸收了紫外/可见辐射光后，发生了电子能级跃迁，而产生了相应的吸收光谱。属于分子吸收光谱。 紫外-可见吸收光谱分析是研究物质在紫外-可见光波下的分子吸收光谱的分析方法。,6.1.2 紫外可见吸光光度法,6.1 吸收光谱技术,6,紫外-可见光区可细分为： （1）10-200nm：远紫外光区 （2）200-400nm：近紫外光区 （3）400-800nm：可见光区,分子吸收光谱产生原理：,图6-1 分子吸收光谱产生原理,原子或分子中的电子，总是处在某一种运动状态之中，每一种状态

3、都具有一定的能量且属于一定的能级。 这些电子由于受光、热、电的激发等多种原因而从一个能级转到另一个能级的过程称为跃迁。 因为这些电子吸收了外来辐射的能量后从低能级跃迁到高能级，因此每一次跃迁都对应着电子吸收一定的辐射能量。具有不同分子结构的各种物质，对电磁辐射有选择性的吸收。,6.1 吸收光谱技术,7,吸光光度法就是基于这种物质对电磁辐射的选择性吸收的特性而建立起来的，在分子吸收光谱形成中所吸收的能量与电磁辐射的频率成正比，即： EE2E1hhc/ (6-1) 式中E是吸收的能量，h为普朗克常数（6.626 10-34 Js）， 是辐射频率，c是光速，为波长。,6.1 吸收光谱技术,8,一般来

4、说，一个分子吸收了外来辐射之后，它的能量变化E为其振动能变化E振、转动能变化E转以及电子运动能量变化E电子的总和，即 EE振E转E电子 （6-2） 在等式右边三项中，E电子最大，一般在110eV。 E振大约比E电子小10倍，而E转约比E振小10倍到100倍。 由于分子内部电子能级变化而产生的光谱通常位于紫外或可见区内，所以叫UV-VIS吸收光谱技术。,6.1 吸收光谱技术,9,分子的电子能级跃迁必定伴随着振动能级和转动能级的跃迁，因此所得的紫外-可见吸收光谱常常不是谱线或窄带，而是由一定宽度的若干谱带系所组成。,朗伯-比尔（LambertBeer）定律: A=lg(1/T)=bc （6-3）,

5、6.1 吸收光谱技术,10,物理意义是当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时, 其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比.,式中: A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度； T：为透过率，是透射光强度比上入射光强度； ：摩尔吸光系数，单位 Lmol-1cm-1； b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位； c：溶液的摩尔浓度，单位 molL-1；,当被测物质含有两种以上的组分时，在单次散射的条件下，在一定波长下的总吸收为各组分在该波长下吸光率之和，即吸光度具有线性叠加性，其表达式为：,图6-2 吸光率加合原理图,6.1 吸收光谱技术,11,（6-4）,吸光率加合原理可以用图6

6、-2来表示，总的吸收光谱特性应该是由不同3种物质独立吸收的总和。,2、特点 紫外可见吸光光度法是利用棱镜或光栅等分光器获得纯度较高的紫外可见单色光； 根据物质对单色光的选择性吸收的特点来测定物质组份的分析方法； 具有灵敏度高、准确度和稳定性较好、适用范围广、所需仪器简单价低廉等优点。,6.1 吸收光谱技术,12,不饱和脂肪族有机化合物,不饱和烃及共轭烯烃、 羟基化合物,芳香化合物,苯及其衍生物,不饱和杂环化合物,饱和有机化合物,饱和烃及其取代衍生物,3、紫外吸收光谱与分子结构的关系,有机化合物的紫外吸收光谱常被用作结构分析的依据：,6.1 吸收光谱技术,13,1、发展历程 利用紫外可见吸收光谱

7、来进行定量分析由来已久，可追溯到古代。公元60年，古希腊人已经开始利用五味子浸液来估计醋中铁的含量，由于最初是运用人眼来进行检测，所以又称比色法。 20世纪30年代产生了第一台光电比色计。 20世纪40年代出现的Bakman UV分光光度计促进了这一学科的进一步发展。 随着电子技术和计算机技术的高速发展，紫外可见分光光度计已开始向着微型化、自动化、在线和多组分同时测定等方向发展并不断取得成果，已成为许多研究领域的一种常用检测手段。,6.1 吸收光谱技术,14,6.1.3 紫外可见分光光度计,系统组成：主要由光源、单色器、样品池、检测器和显示器五大部分组成。 工作过程：由光源产生的连续辐射，经过

8、单色器后变为单色光，通过样品池（架）的待测样品后，一部分光被吸收，而未被吸收的光穿过样品到达检测器，光信号转化为电信号并放大和处理，最终信号数据被记录或由显示器显示。,2、紫外-可见分光光度计的基本构造,6.1 吸收光谱技术,15,1）光源 在整个紫外光区或可见光区可以发射连续光谱(1801000nm) ，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。 可见光区常用的光源是钨灯或碘钨灯，波长范围是350-1000 nm。 在紫外区常为氢灯或氘灯，发射的连续波长范围是180-360 nm。,6.1 吸收光谱技术,16,卤钨灯,钨灯,6.1 吸收光谱技术,17,6.1 吸收光谱技术,18,2）

9、单色器 单色器是将光源辐射的复合光分成单色光的光学装置。它是分光光度计的心脏部分。单色器一般由狭缝、色散元件及透镜系统组成。关键是色散元件，最常见的色散元件是棱镜和光栅。高质量的单色器可以降低杂散光，使检测更为精确。 狭缝：将单色器的散射光切割成单色光。直接关系到仪器的分辨率。狭缝越小，光的单色性越好。分为入射狭缝和出射狭缝。 棱镜:玻璃3503200 nm，石英1854000 nm。 光栅:波长范围宽，色散均匀，分辨性能好，使用方便。,6.1 吸收光谱技术,19,6.1 吸收光谱技术,20,狭缝,单色器,6.1 吸收光谱技术,21,3）吸收池 用于盛装试液的装置。吸收材料必须能够透过所测光谱

10、范围的光。一般可见光区使用玻璃吸收池，紫外光区使用石英吸收池。 规格有0.5、1.0、2.0、5.0cm 等。 样品池也称为比色皿，是由玻璃或石英组成的长方形容器，可装入待测的溶液。固体样品可用玻璃或石英材料的载玻片夹放并固定在样品架上测量。最新的光度计还配有恒温池架和超微量池架等附件，可用于特殊样品的光谱测量。 在高精度的分析测定中（紫外区尤其重要）吸收池要挑选配对，因为吸收池材料的本身吸光特性以及吸收池的光程长度的精度等对分析结果都有影响。,6.1 吸收光谱技术,22,比色皿,氘灯,石英比色皿,6.1 吸收光谱技术,23,4. 检测器 利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号 ，并

11、进行放大和处理。常用的有光电管、光电倍增管、光电二极管等。 要求灵敏度高、响应时间短、噪声水平低、稳定性好的优点。 新型光度计一般都采用光电倍增管，其光电流放大倍数为106107。,5. 显示器 将放大处理后的信号显示和记录的装置。新型光度计都采用计算机作为显示和记录器，并通过Windows界面人机交互，不仅能对数据进行各种处理，而且还能对光度计进行各种控制与操作。,6.1 吸收光谱技术,24,PMT,6.1 吸收光谱技术,25,TU-1901型紫外可见分光光度计,6.1 吸收光谱技术,26,UV-1801紫外/可见分光光度计,6.1 吸收光谱技术,27,紫外可见分光光度计（UV-2601）,

12、6.1 吸收光谱技术,28,(一)按仪器使用波长分类： 真空紫外分光光度计（0.1-200 nm）； 可见分光光度计（350-700 nm）； 紫外-可见分光光度计（190-1100 nm）； 紫外-可见-红外分光光度计（190-2500 nm）； （二）按仪器使用的光学系统分类： 单光束分光光度计； 双光束分光光度计 双波长分光光度计 动力学分光光度计,3、紫外-可见分光光度计的分类及特点,6.1 吸收光谱技术,29,早期的分光光度计大多属于这种类型，特点是从光源到检测器只有一条光路。 经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比溶液和样品溶液，以进行吸光度的测定。 简单，价廉，适于在给定波长处

13、测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。,1）单光束分光光度计,6.1 吸收光谱技术,30,1.单波长单光束分光光度计,特点： 使用时来回拉动吸收池 移动误差 对光源要求高 比色池配对,工作过程：光源发出的光经过凹面聚光镜、平面反射镜等一系列光器件后，通过狭缝和样品池（架），最终到达光电倍增管，经过转换和放大处理后，信号被显示或记录下来。这类光度计的特点是光路简单，但需要进行空白调零操作，且不能克服背景噪声对测量的影响。,6.1 吸收光谱技术,31,光源经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光，一束通过参比池（样品光路），一束通过样品池（参比光路）。

14、光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。 自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。,M2,M3,）双光束分光光度计,6.1 吸收光谱技术,32,工作过程：从光源D2和W发射的辐射经反射镜M1、平面反射镜M2、入口狭缝S1达到准直镜M3形成平行光束，达到光栅G，被色散后经反射镜M3，出口狭缝S2，再经扇形镜Se1和反射镜M4，交替地进入样品池（架）和参比池（架），最后又交替地经过Se2，最终到达光电倍增管PM，并经过转换和放大处理后被显示或记录下来。 双光通

15、路可以自动消除空白吸收，不需要进行空白调零操作。,双光束分光光度计的光路图,6.1 吸收光谱技术,33,特点： 不用拉动吸收池，可以减小移动误差 对光源要求不高 可以自动扫描吸收光谱,）双波长分光光度计 由同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个单色器，得到两束不同波长（1和2）的单色光；通过折波器以一定的频率交替通过同一样品池，然后由检测器交替接收信号，最后由显示器显示出两个波长处的吸光度差值A。 无需参比池。A就是扣除了背景吸收的吸光度。,6.1 吸收光谱技术,34,对于多组分混合物、混浊试样（如生物组织液）分析，以及存在背景干扰或共存组分吸收干扰的情况下，利用双波长分光光度法，往往能提高

16、方法的灵敏度和选择性。利用双波长分光光度计，能获得导数光谱。,双波长 BECKMAN-DU_640,6.1 吸收光谱技术,35,）动力学分光光度计 解决在光化学反应、辐射化学反应和酶催化反应中，能量转化、酶的降解、生物合成等的反应变化。 特点：时间辨别、快速扫描、测定生物化学瞬间产物的吸收光谱和随时间变化值。,6.1 吸收光谱技术,36,波长范围：表示仪器能测定的波长范围。波长范围越大，仪器越好，这与仪器使用的灯有关。 波长精度：表示仪器单色器波长误差程度。波长误差越小，仪器精度越高，这与仪器使用的单色器有关。 杂散光：表示单色光的纯度，这与制作单色器的材料和加工工艺有关。,4、紫外-可见分光

17、光度计主要技术指标,6.1 吸收光谱技术,37,光度的测量精度：表示仪器每次测定显示读数的精确度，即仪器能准确读小数点后几位。位数越多，仪器精度越高，这与仪器使用的检测系统有关。 光度测量的重现性：每次A读数的重现性，这与仪器使用的检测器的质量有关。 分辨率：表示仪器分辨吸收光谱微细结构的能力，即指仪器对于紧密相邻的峰可分辨的最小波长间距，这是衡量仪器性能的一个综合指标。,6.1 吸收光谱技术,38,5、影响紫外可见吸收光谱的主要因素 （1）仪器的单色性（分辨率）: 郎伯-比尔吸收定律只有在入射光为单色光（指单一波长）时成立。而紫外可见分光光度计测量用的入射光是通过连续辐射光源和单色器获得的，

18、为了得到一定强度的光强，狭缝不可能很窄，因而入射光不是纯单色光而是有一定的光谱通带。光谱通带的宽度和光谱分辩率成反比。 （2）化学变化: 当被测物浓度过高时，粒子之间有相互作用，影响光谱的准确性；此外有些物质在光辐射下发射光化学反应而退色，或者产生荧光或磷光，使吸收物质的性质发生变化，从而引起偏差。 （3）散射的影响: 郎伯-比尔吸收定律要求吸收物质应当是均匀的，只发生单次散射和透射。这就要求待测物质若是溶液，则浓度不应过大；对于生物组织等样本则要求厚度要尽可能小（100m），否则宜造成偏差。,6.1 吸收光谱技术,39,6、紫外-可见吸收光谱法的应用,1）定性分析 通常根据吸收光谱的形状、吸

19、收峰的数目以及最大吸收波长的位置和相应的摩尔吸收系数进行定性鉴定。 一般采用比较光谱法：即在相同的测定条件下，比较待测物与已知标准物的吸收光谱曲线，如果它们的吸收光谱曲线完全等同，则可认为是同一物质。,6.1 吸收光谱技术,40,2）结构分析 判断所含官能团、有机化合物的同分异构体。 （例如：某一化合物在250-300nm有强吸收带，则表示存在苯环的特征吸收；若在210-350nm有强吸收带，则可能含有两个双键的共轭单位。） 3）纯度鉴定 根据在吸收光谱最大吸收峰的位置和峰形状、数量判断该物质的纯度。 4）定量分析 根据朗伯比尔定律，物质在一定波长处的吸光度与它的浓度呈线性关系。所以通过测定溶

20、液对一定波长入射光的吸光度，便可求得溶液的浓度和含量。紫外可见分光光度法不仅用于测定微量成分，而且用于常量组分和多组分混合物的测定。,6.1 吸收光谱技术,41,定性分析与定量分析的基础,定性分析基础,定量分析基础,物质对光的选择吸收物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构成了物质对光的选择吸收基础。,在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质的浓度成正比。,吸收曲线,6.1 吸收光谱技术,42,6.1.4 吸收光谱在生物医学领域的应用 在生物组织中，吸收主要由水分子和蛋白质以及色素等大分子引起。蛋白质和色素主要吸收的是紫外光和可见光，而在光谱红外区的吸收主要是水分子引起。 生物医学领

21、域利用吸收光谱做研究已取得很多的研究成果 Wayne A. Ciesielski等研究了在不同温度和pH下肌球素吸收光谱，肌球素是骨骼肌和心肌中的一种重要的氧传输分子。他们研究发现在相同的pH下，在每10温度变化下，肌球素的吸收光谱在760nm附近有0.9-1.2nm的峰移现象；而在相同的温度下，pH不同肌球素的峰移现象并不明显。这一研究表明，温度变化是标定和测试吸收光谱的主要误差因素。,6.1 吸收光谱技术,43,苏玉玲和张晓冬等分别运用分光光度计对恶性骨肿瘤患者的血清和食管癌患者的血浆进行吸收光谱检测。肿瘤患者在414nm处和健康人血清的吸收光谱有明显差异。图6-4是正常人与骨肿瘤患者血清

22、的吸收光谱。同时他们通过其特征谱带的吸光度比值（I279 / I253）作为特征值作为进行统计分析,结果发现在20 例正常人血清中,有19例血清光谱的比值都大于1.87；但在10例恶性骨肿瘤患者血清中,有7例患者血清光谱的比值都小于1. 87；而对于食管癌患者和正常人血清分析,其特征谱带的吸光度比值（I277.0 / I253.5），正常人血浆的光谱比值71. 4 %都大于1.8 , 而食管癌血浆的光谱比值87.5 %都小于1.8。他们判断这一吸收峰可能是红细胞的贡献，表明肿瘤患者红细胞寿命短，容易发生溶血现象，从而引起吸收光谱的差异。总之,可以通过血浆吸收光谱中某些特征谱带的吸光度比值来初步

23、诊断癌症患者, 为早期快速诊断食管癌提供了一种新的思路。,6.1 吸收光谱技术,44,图6-4 恶性骨肿瘤患者血清与健康血清的吸收光谱,6.1 吸收光谱技术,45,熊建文等研究了用于光动力治疗肿瘤常用的光敏剂5-氨基酮戊酸（5-aminolevlinic acid , ALA）在不同条件下的吸收光谱。如图6-5所示，结果表明单纯ALA的最大吸收峰在270nm；在培养液中ALA浓度增加则吸收加大；而在同一浓度下白血病细胞浓度增大则吸收减小。,图6-5 不同条件下 ALA的吸收光谱,6.1 吸收光谱技术,46,如图6-6所示，徐正红研究了家兔心室不同厚度（40、45、50和55 m）组织切片的吸收

24、光谱。其中图6-6（a）是不同厚度切片的吸收光谱，而图6-6 （b）是其强度归一化后的吸收光谱。从图中可以看出，随着光波波长的减小，组织的吸收增大，但在400450nm有一个明显的吸收峰。此外，将组织不同厚度切片的吸收光谱的强度归一化后其峰位基本不变。,6.1 吸收光谱技术,47,（a） 不同厚度切片的吸收光谱 （b） 不同厚度切片强度归一化后的吸收光谱图 图6-6 左心室组织切片的吸收光谱,47,Quiz 1,什么是吸收光谱技术？ 吸收光谱技术在生物医学领域的应用有哪些？,48,6.1 吸收光谱技术 6.2 荧光光谱技术 6.3 拉曼光谱技术,本 章 内 容,49,6.2 荧光光谱技术,6.

25、2.1 荧光光度法 原理与特点 荧光光谱的分类 影响生物荧光的主要因素 6.2.2 荧光物质 自体荧光发色团 荧光探针 量子点 6.2.3 荧光光度计 6.2.4 稳态荧光光谱的应用 6.2.5 瞬态荧光光谱的应用,50,6.2.1 荧光光度法 1、原理与特点 荧光的产生原理主要基于Stokes效应，包括以下三个过程： （1） 物质的分子吸收一定的光能，从基态激发到激发态； （2） 分子从高能态很快（约1012s）到一个不稳定的高能级； （3）当分子从不稳定的高能态返回基态时会伴随光子产生，即有荧光产生。,图6-7 荧光产生的原理图,6.2 荧光光谱技术,51,荧光光谱有以下特点： （1）荧光

26、光谱的形状和激发光波长无关。这是因为荧光的产生是由第一电子激发态的最低振动能级开始的,而和荧光物质分子被激发至哪一个能级无关； （2）荧光光谱的形状和吸收光谱的形状十分相似但不一定重合。近似是因为吸收光谱反映的是第一电子激发态的能级分布情况，荧光光谱反映的是基态能级的分布情况。由于基态中能级的分布和第一电子激发态中的能级分布是相类似的，所以荧光光谱的形状与吸收光谱近似。但由于测量仪器等因素的影响，大多数情况下得到的激发光谱与吸收光谱不重合。,6.2 荧光光谱技术,52,和紫外可见吸收光谱进行物质的定性、定量分析相比，荧光分析法有以下优点： （1） 灵敏度高 （2） 特异性好，而且荧光光谱可以检

27、测那些紫外-可见吸收光谱检测不到的过程,6.2 荧光光谱技术,53,2、荧光光谱的分类 荧光光谱包括内源性（如组织体自体荧光）光谱和外源性（如药物）荧光光谱。 根据所选用的不同激发光源和检测方式，荧光光谱可以分为稳态和时间分辨（瞬态）荧光光谱。前者主要测量荧光的激发光谱、发射光谱、三维荧光光谱等；后者主要表现对荧光寿命的检测。,6.2 荧光光谱技术,54,6.2 荧光光谱技术,55,（1）荧光激发光谱 简称激发光谱（Excitation Spectrum），是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率。,（a）在心室组织中染料di-4

28、-ANEPPS在570nm时的荧光激发光谱,6.2 荧光光谱技术,56,（2）荧光发射光谱 （Emission Spectrum） 在某一固定波长的激发光作用下，荧光强度在不同波长处的分布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。 同一荧光物质其荧光光谱的形状与激发波长无关。不同荧光物质的结构不同，其基态与高能态间的能量差不一样，而基态中各振动能级的分布也不一样，所以产生的荧光光谱是不同的，由此可以用荧光光谱进行定性分析。当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时，物质在一定浓度范围内，其发射光强度与溶液中该物质的浓度成正比关系，可以用作定量分析。,6.2 荧光光谱技术,57,b）心脏

29、不同部位组织在340nm激发光下的荧光发射光谱,（3）三维荧光光谱 在荧光激发光谱和荧光发射光谱测量的基础上，近十几年还发展起来一种新的荧光分析技术三维荧光光谱。这种技术和普通光分析技术的不同之处在于，一般的荧光激发谱和荧光发射谱是二维的，反映的是荧光物质随激发波长或发射波长的荧光光强变化；而它是三维的，即可以获得激发波长与发射波长同时变化时的荧光强度信息。,6.2 荧光光谱技术,58,（c） 新鲜心室组织三维荧光光谱 （等角三维投影图）,（4）时间分辨荧光光谱 以上三种光谱是稳态荧光光谱，而时间分辨荧光光谱是测量荧光寿命。 不同的荧光物质在一定波长的激发光和荧光检测波长下具有不同的荧光寿命，

30、根据时间分辨荧光光谱，可以区分不同的荧光物质。尽管样本的荧光寿命也随激发波长和荧光检测波长的不同而发生变化, 但在相同测试条件下，生物生化特性的差异会导致荧光寿命的差异，可利用这一特性进行癌症早期诊断。,6.2 荧光光谱技术,59,（d）488nm癌细胞（MOL T-4）（曲线1）与正常细胞（曲线2）的时间分辨荧光光谱,3、影响生物荧光的主要因素 影响荧光强度的主要因素是荧光量子产额f，其定义为： 它反映了荧光物质发射荧光的能力，其值越大物质发射出的荧光也越强。,6.2 荧光光谱技术,60,影响生物荧光的主要因素有： （1）样本种类：不同生物样本含有不同的荧光物质，相同荧光物质浓度和分布也不相

31、同，其荧光强度和谱的形状是不同的。 （2）生物新陈代谢水平：某些生物的荧光物质的浓度是和生物的新陈代谢水平相关的，可以反映样本活性。 （3）环境温度：温度降低，荧光的量子产额和荧光光强增大。 （4）pH值：酸碱度变化会影响有关荧光物质的分布，从而也影响荧光光强。 （5）处理方式：同一离体样本在不同的处理步骤和放置环境下（如灌注、冷冻等），其生化特性不同则荧光光谱会存在差异。,6.2 荧光光谱技术,61,6.2.2 荧光物质 能发出荧光的物质称为荧光发色团。生物的荧光物质可以根据发色团种类不同分为两大类：自体荧光发色团和荧光探针（也称药物荧光剂）。 1、自体荧光发色团 所谓“自体荧光”是指无需外

32、加光敏物质，生物组织被一定波长的光激发后, 处于激发态的分子在回到基态的过程中, 以光子的形式释放所吸收的能量，即产生了荧光。,6.2 荧光光谱技术,62,组织内产生自体荧光必须具备三个条件： （1）组织中包含足够浓度的内源性荧光物质，如卟啉（Pyridoxine）、色氨酸（Tryptophon）、胶原质（Collagen）、弹性蛋白（Elastin）、还原烟碱腺嘌呤二核苷酸（NADH）和黄素（flavins， FAD）等； （2）组织能吸收激发的光子，不同内源性荧光物质的吸收波长范围不相同； （3）组织能辐射出次级光子，即荧光。不同内源性荧光物质发出荧光的波长不同，有些波长范围包含不同物质的

33、荧光，其光谱有重叠现象。,6.2 荧光光谱技术,63,影响自体荧光的因素 1）新陈代谢 2）样本种类 3）温度 4）pH值 5）样本处理方式,6.2 荧光光谱技术,64,自体荧光的应用 1）可以检测和确定组织的生化成份和含量。荧光发射光谱是不同组织、不同的结构、不同的生化和物化特性等生物组织本质信息的真实反映，相同组织荧光光谱相似，不同组织的荧光光谱存在差异。 2） 可以作为癌症早期诊断的依据。肿瘤组织及其它病变组织的生长特性和局部环境不同于相应的正常组织。这是因为组织的物理和化学特性都发生了变化, 导致内源荧光发色团的浓度或空间分布，发色团的微环境以及局部组织结构等发生改变，造成样本自体荧光

34、光谱在荧光强度、峰值位置、峰值变化速率、不同峰值之间的比值和荧光寿命等方面会存在差异。这些光谱变化反映了病变细胞及组织的特异性。,6.2 荧光光谱技术,65,自体荧光团激发与发射谱列表,6.2 荧光光谱技术,66,2、荧光探针 为了检测生物分子的各种信息，可以在检测物中加入外源性或内源性的荧光剂，这些荧光剂也称为“荧光染料”、“荧光探针”、或“荧光标记”。可以作为示踪剂、荧光免疫测定剂和抗原/抗体感受器从单细胞或单分子水平对生物大分子的结构、功能及相互作用等信息进行观测。 生物荧光检测常用的荧光探针主要有 3 种类型： （1）微环境探针：这种探针的荧光性质（激发和发射波长、强度、寿命、偏振等）

35、随所处环境的性质，如极性、折射率、粘度等改变而灵敏地改变，也称为“疏水探针”。 （2）分子运动探针：这种探针通过荧光极化、相互作用分子间的电子迁移或激发信息来反映分子动力学信息。 （3）结构探针：这种探针通过荧光极化、相互作用分子间的电子迁移或激发信息来反映分子间力学信息。,6.2 荧光光谱技术,67,The most striking examples of fluorescence occur when the absorbed radiation is in theultravioletregion of thespectrum, and thus invisible to the hu

36、man eyes, and the emitted light is in the visible region.,6.2 荧光光谱技术,在生物医学研究与应用领域常用的荧光探针如下： （1）测定细胞活性的探针：如分子探针公司LIVE/DEAD细胞活性检测试剂盒可以测定细菌、真菌和更高级的真核细胞活性/毒性；钙黄绿素和荧光黄等探针是那些在健康细胞中才有酶活性的酶底物。 （2）膜荧光探针：主要用于生物膜结构以及脂质运转和代谢动力学研究，常用的探针有DPH（二苯基已三烯）及其衍生物、BODIPY、NBD（硝基苯二唑磷脂酰胆胺、芘黄（石旁）酰胺等。,6.2 荧光光谱技术,69,（3）细胞器荧光探针：大

37、量细胞通透性的荧光染料可以选择性标记活细胞的线粒体、溶酶体、内质网和高尔基复合体，可以研究呼吸作用、有丝分裂、凋亡、多药抗性、底物降解和解毒作用、细胞内底转运和分检等研究。常用的探针有绿色荧光蛋白、MitoTracker探针、MitoFluor探针、LysoTracker探针、LysoSensor等。 （4）Ca2、Mg2、Zn2和其它金属离子探针：用于研究这些金属离子与生命活动的关系，不同浓度金属离子有不同的探针。常用的Ca2探针多是Ca2的鳌合剂，包括钙绿、钙橙、水母素，还有Fura2，Indo1，Fluo3，Fluo4及其衍生物等。荧光Mg2探针有镁绿探针以及MagFura2，MagFu

38、ra5和MagFluo4等。常用的Zn2探针有FuraZin1，IndoZin1，FluoZin3等。,6.2 荧光光谱技术,70,（5）pH荧光探针：研究细胞内pH值对不同生理和病理过程作用，常用的探针有SNAFL探针、SNARF探针、荧光黄和羧基荧光黄和LysoSensor探针等。 （6）其他：生物信息检测用的还有活性氧和一氧化碳探针、信号转导探针、入胞作用、受体和离子通道探针、荧光原位杂交探针等。,6.2 荧光光谱技术,71,荧光染料的缺点： 荧光探针一般都是有机染料，有机染料有两个缺点： 1） 染料荧光有可能被细胞的自体荧光所覆盖； 2）有机染料具有光漂白特性，无法长时间检测。,6.2

39、 荧光光谱技术,72,Aequorea victoria,Green Fluorescent Protein(GFP) is fluorescent, which is found in the photoorgans of the jellyfish Aequorea victoria. GFP is used as an important research tool in biomedicine.,Aequorea victoria photoorgans,6.2 荧光光谱技术,3、荧光蛋白,The importance of GFP was recognized in 2008 whe

40、n the Nobel Committee awarded Osamu Shimomura, Marty Chalfie and Roger Tsien the Chemistry Nobel Prize for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP.,6.2 荧光光谱技术,The diversity of genetic mutations is illustrated by this San Diego beach scene drawn with living bacteria expres

41、sing 8 different colors of fluorescent.,GloFish, the firstpetsold with these proteins artificially present.,Why is GFP so popular? Using GFP we can see when proteins are made, and where they can go. Many different mutants of GFP have been engineered, such as BFP, CFP and YFP. Thus more spectra are p

42、roduced and wider applications are found.,6.2 荧光光谱技术,4、量子点 量子点是一种由族（如CdSe、CdTe、CdS和ZnSe等）或-族（InP和InAs等）元素组成的，直径在1100 nm之间的半导体纳米颗粒。当颗粒的物理尺寸小于激子的玻尔半径（exciton Bohr radii）时，由于量子尺度效应，使其具有独特的光学和电子学性质。,6.2 荧光光谱技术,76,与传统的有机染色分子相比，量子点有如下优点： （1）量子点的荧光发射波长可以通过改变量子点粒径的大小和其化学组成来改变，其荧光发射光谱覆盖了从近紫外光（400 nm）到近红外光（2

43、000 nm）的光谱范围。 （2）不同尺度的量子点可以被同一波长的激发光激发，发出不同波长的发射光，光谱不重叠，便于同时观测不同种类的生物信息。而传统有机染料的荧光谱峰宽且不对称，并且吸收光谱窄。若要观察到多种染料的荧光,必须同时用多种不同波长的激光来激发，且光谱容易有重叠，很难同时进行多目标检测。 （3）量子点的荧光发射光强是有机荧光染料的10-20倍，且其光漂白作用很小，光化学性质十分稳定，不易因化学作用和生物代谢降解，荧光可持续数周或更长时间，而且它可以经受反复多次激发，不容易发生荧光淬灭，这样可以动态观察细胞或蛋白质的动力学过程 ，不会对组织细胞造成伤害。,6.2 荧光光谱技术,77,

44、78,78,6.2 荧光光谱技术,6.2.3 荧光光度计 1、基本结构： 物质的激发光谱、发射光谱和时间分辨荧光光谱等通常是采用荧光分光光度计来测量的。 荧光光光度计一般由光源、单色器、样品仓、检测器、机械装置和控制电路所组成。 目前荧光分光光度计的常用光源为氙灯,单色器多用光栅,检测器主要用光电倍增管,普通荧光分光光度计的激发和发射波长一般在200900nm。,6.2 荧光光谱技术,79,荧光辐射是从样品表面散射的，其在所有方向发射都相同，原则上可以从任何角度进行观测。但从仪器设计和应用的观点来看，最方便且目前广泛使用的方式是入射光与荧光的夹角为90，探测器测量的是从样本表面散射出的荧光；而

45、紫外可见分光光度计的入射光和出射光夹角是180，探测器测量的是通过样本的透射光。 HITACHI F-4500 荧光分光光度计是日立公司产品，采用水平光束测量，它不仅可以测量样品的激发谱、发射谱、三维荧光光谱，还能测量物质的荧光寿命组成时间分辨光谱。三维荧光光谱可以显示为等角三维投影图和等高线光谱图。,6.2 荧光光谱技术,80,光度计的氙灯功率为150w；测量范围200900nm；分辨率1.0 nm；波长精度0.2nm；最小取样量仅0.6mL。 下面以F-4500 荧光分光光度计为例介绍荧光光度计的系统组成，其硬件部分包括光学系统和信号处理/控制系统。,6.2 荧光光谱技术,81,HITAC

46、HI F-4500 荧光分光光度计,2、光学系统 HITACHI F-4500 荧光分光光度计的光学系统图如图6-10所示。氙灯发出的光束，通过透镜L1和L2，经过单色器的入口狭缝S1，到达激发光衍射光栅上，然后从出口狭缝S2出来，照到凹面镜M1；再通过光束分裂器分成两束光，一束光送到监控检测器上，在这儿光通量被测量；另一束光通过凹面镜M2和M3照到样品池上。,6.2 荧光光谱技术,82,图6-10 F-4500光度计光学系统图,来自样品池的荧光和发射光，经过凹面镜M4和平面镜M5，进入发射光单色器的入口狭缝，再经过发射光衍射光栅，从出口狭缝S4出来，再通过凹面镜M6反射到光电倍增管上，在此进

47、行荧光强度的测量。,图6-10 F-4500光度计光学系统图,6.2 荧光光谱技术,83,3、信号处理与控制系统 F-4500的信号处理和控制系统的框图如图6-11所示。,6.2 荧光光谱技术,84,从氙灯发出的光束，照射到激发光单色器上，再通过光束分裂器，照射到监控检测器上，所有的驱动元件（包括波长电机、狭缝控制电机和断路器电机）是由内部计算机发出的信号来操作的。此外，从监控检测器和荧光测量检测器（即光电倍增管）发出的输出信号被输送到A/D转换器上，先经过内部计算机处理后再把输出信号传入电脑。,图6-11 信号处理/控制系统（F-4500）,4、控制及分析软件 用人机对话的界面来调控测量模式

48、、激发光和发射荧光的波长、扫描速度、扫描时间、狭缝宽度、灵敏度、光电倍增管的电压值等参数。此外，荧光光度计一般还具有自动校准和自我诊断功能。与光度计配套的光谱处理软件可以对测量的各种数据进行滤波、自动寻找光谱的峰值和谷值、光谱的加减处理、谱面积计算以及求出一阶、二阶导数谱等数据处理功能。生物组织存在不同的荧光物质，在某一波长的激发光下仅可能得到几种物质的荧光发射光谱。随着计算机技术的不断发展，荧光光度计的操作和数据处理的自动化程度也会不断提高。,6.2 荧光光谱技术,85,6.2.4 稳态荧光光谱的应用 1、自体荧光光谱 徐正红研究了新鲜与冰冻48小时家兔心室组织的自体荧光光谱，如图6-12所

49、示。从中发现在激发波长EX=320400nm， 荧光发射波长EM400600nm的区域，光谱对应的主要荧光物质是胶原质、弹性蛋白和NADH。 和新鲜组织相比，冰冻后心室组织荧光强度衰减很明显，其光谱差异表明在心室组织中这些荧光物质的含量是不同的。黑色箭头所指部分是黄素的激发发射对，冰冻后心房和心室组织这一部分的荧光明显增强。,6.2 荧光光谱技术,86,图6-12 家兔新鲜和冰冻心室组织的三维荧光光谱,6.2 荧光光谱技术,87,D. Parmeswaran等测量了含喉部正常上皮细胞和癌细胞悬浮液的自体荧光光谱，激发光从275 -310 nm变化，通过测量的荧光发射光谱（290500nm）可以

50、发现这两种组织的光谱的谱形有明显区别。对应于不同的激发光，正常细胞的荧光强度比FI340/FI440，FI350/FI400都明显小于癌细胞，由此可以来区分两种细胞。 王伟等研究了正常肺组织和肺癌组织激光诱发自体荧光光谱，结果发现，正常肺组织和肺癌组织的主峰位置不同; 肺癌组织的相对荧光强度大于正常肺组织；正常肺组织在560 nm 及600 nm 处有2个次峰，而肺癌组织的荧光峰平滑下降；正常肺组织在580nm与600nm的荧光强度比小于肺癌组织。实验证明，正常肺组织和肺癌组织的激光诱发自体荧光光谱有明显区别，可用于区分二者。,6.2 荧光光谱技术,88,Jonathan D. Pitts 等

51、运用荧光光谱测定法和共聚焦荧光显微法对正常和癌变支气管上皮细胞进行检测，他们发现色氨酸是主要的荧光发色团，两种细胞的色氨酸发射强度没有区别，而癌细胞的NADH和黄素荧光强度有明显减少。测量了在相同强度（1mW）波长为410nm的激发光下，膀胱正常粘膜和乳头状瘤组织波长300800nm的自体荧光。结果表明，乳头状瘤在500550nm范围内的荧光强度明显低于正常组织。,6.2 荧光光谱技术,89,2、药物荧光光谱 与自体荧光相比, 特定光敏剂的荧光不仅信号较强, 而且特征明确, 有利于增强肿瘤组织与周围正常组织之间的荧光差异。 电压敏感染料是一种膜荧光探针，可以检测细胞膜的跨膜电位。按照染料对膜电

52、位变化的反应速度来划分，电压敏感染料可以分为慢反应电压敏感染料和快反应电压敏感染料，目前快反应电压敏感染料的应用更广泛。,6.2 荧光光谱技术,90,6.2.5 瞬态荧光光谱的应用 组织体的荧光寿命随激发波长和荧光检测波长的不同而发生变化，但在相同测试条件下正常组织和癌变组织的荧光寿命存在显著差异，结果见表6-2。 特别是利用光敏剂进行检测时，由于光敏剂的荧光寿命（16ns左右）远大于人体组织的自体荧光寿命（16ns），两者的差异更加明显，有利于提高组织光活检的特异性。,6.2 荧光光谱技术,91,表6-2 正常和癌变组织的荧光寿命,6.2 荧光光谱技术,92,光谱分辨的荧光寿命测量是十分必要

53、的。,光谱分辨的荧光寿命 由于荧光发射波长与荧光团的能级结构有关，因此荧光光谱测量与光学显微技术相结合可以区分样品的分子种类或鉴别不同的荧光团，并能够对空间分辨的生物化学功能信息进行成像。 荧光寿命对荧光团所处微环境非常敏感，能够对离子浓度（Ca2+, Na+）、pH值和 pO2等生理生化参数进行定量测量，是区分光谱重叠的荧光团的有效方法。因此它是一种非侵入性获取样品功能信息的方法。 荧光光谱和荧光寿命测量相结合能够为生物医学检测和分析提供不同但互补的功能信息。,6.2 荧光光谱技术,93,6.1 吸收光谱技术 6.2 荧光光谱技术 6.3 拉曼光谱技术,本 章 内 容,94,6.3 拉曼光谱

54、技术,6.3.1 拉曼光谱的发展 6.3.2 拉曼光谱的基本原理 拉曼效应和拉曼位移 特征拉曼频率 退偏比 6.3.3 拉曼光谱的特点 6.3.4 拉曼光谱仪 6.3.5 拉曼光谱的应用 振动模式的研究 无机物及金属络合物的研究 有机物结构分析 在高聚物分析中的应用,95,6.3.1 拉曼光谱的发展 1923年德国物理学家A.Smekal首先预言了光的非弹性散射； 1928年，印度物理学家拉曼用水银灯照射苯液体，发现了新的辐射谱线，这是属于一种新的分子辐射，称为拉曼散射。（1930年获Nobel奖，第一个获奖的亚洲人）。 20世纪50年代，拉曼光谱只是物理学上的振动光谱研究和教学上的示范。 2

55、0世纪60年代，自从激光器被用作光源以来，凡是红外光谱可测的试样，激光拉曼光谱几乎同样可测。甚至有些红外光谱测定有困难的试样，激光拉曼光谱也都可测。但仍未得到工业分析人员的广泛应用。,6.3 拉曼光谱技术,96,1986年，Hirschfeld首次报道了固体和液体的近红外傅里叶变换拉曼光谱，FT-Raman光谱仪的问世又一次推动了拉曼光谱的发展，得到工业分析人员广泛应用。 据近年来的报道，在高分子化合物、有机金属络合物、水溶性生化有机试剂的测定方面，激光拉曼光谱比红外光谱有更胜一筹之处，现在拉曼光谱已不是单纯测定物质结构的工具，它在包括生物化学、生物物理和生物医学在内的研究中进展迅速。 我国：

56、1970年以前，激光拉曼光谱仪的生产在我国是空白，1974年才开始研究，1976年研制成功第一台WFL型激光拉曼光谱仪。,6.3 拉曼光谱技术,97,6.3.2 拉曼光谱的基本原理 1、拉曼光谱、拉曼效应和拉曼位移 拉曼光谱是分子的光散射现象所产生的。 所谓光散射现象就是单色光通过物质时发生的能量偏离效应，也就是散射光频率与入射光频率的偏离。 这种频率的位移，与分子的振动和转动有关，记录频率的位移，即可得到拉曼光谱。,6.3 拉曼光谱技术,98,拉曼效应： 当频率为0的单色辐射照射到物质上时，大部分入射辐射透过物质或被物质吸收，只有小部分辐射被样品分子散射。入射的光子和物质相碰撞时，可发生弹性

57、碰撞和非弹性碰撞。 在弹性碰撞时，光子与分子之间不发生能量交换，光子只改变运动方向而不改变频率（0），这种散射过程叫弹性散射，亦称为瑞利散射（Rayleigh Scattering）。 在非弹性碰撞时，光子与分子之间发生能量交换，光子不仅要改变运动方向，还放出一部分能量给分子，或分子吸收一部分能量，从而改变了光子的频率。,6.3 拉曼光谱技术,99,由非弹性散射引起的含有其他频率的散射光的现象称为拉曼效应，这种散射过程称为拉曼散射（Raman Scattering）。 比入射辐射频率0低的散射线（0 -1）称为斯托克斯线（Stokes lines）, 高于入射辐射频率0的散射线 （0 +1）称

58、为反斯托克斯线（Anti-Stokes lines）。,6.3 拉曼光谱技术,100,拉曼效应的能级解释 斯托克斯线、反斯托克斯线与入射辐射之间的频率差1称为拉曼位移： 式中，E1和E0分别为高低两个不同振动能级的能量； 由此可知，拉曼位移与入射光频率无关，而与样品分子的振动能级有关。,6.3 拉曼光谱技术,101,拉曼散射和瑞利散射的能级图,6.3 拉曼光谱技术,102,E0和E1是分子振动（或转动）能级，可能发生的一种情况是，处于基态E0的分子受入射光子的激发而跃迁到受激虚态（图中的虚线表示），然后很快从虚态跃迁回到基态，把吸收的能量以光子的形式释放出来，这就是弹性碰撞，对应于瑞利散射。

59、受激虚态的分子还可以跃迁回到激发态E1，这时分子吸收了部分能量h1 ，并释放出光子，这就是非弹性碰撞，对应于拉曼散射，所产生的散射光称为斯托克斯线。,另一种情况是，处于激发态E1的分子受入射光子的激发而跃迁到受激虚态，然后跃迁回到激发态E1，释放出同频率的光子，即瑞利散射，但也可能跃迁回基态E0，这时分子失掉了 h1的能量，并释放出能量为h(0+1) 的光子，即为反斯托克斯线。 斯托克斯线和反斯托克斯线统称为拉曼谱线，由波尔兹曼定律可知，在通常情况下，分子绝大多数处于振动能级基态，所以，斯托克斯线的强度远远强于反斯托克斯线。,6.3 拉曼光谱技术,103,拉曼散射和瑞利散射的能级图,2、特征拉曼频率 拉曼光谱中的振动频率是用来确定原子团和化学键的特性，这个振动频率称为拉曼频率。 分子振动时键长和键角同时发生变形，若把一个基团的振动看作孤立的振动并不与邻近的基团发生耦合作用，则这个振动的频率和强度便是该基团的特征。 但任何基团的振动不可能是完全孤立的，它必