分子诊断技术在结核病诊治中的应用.ppt

1、分子诊断技术在结核病诊治中的应用,武汉大学人民医院检验医学中心 李 艳,全球结核病流行状况,WHO report，2013,全球结核病流行状况,全球结核感染人数2004年后处于下降趋势 HIV患者并发结核病数量处于平稳阶段 中国结核感染人数全球排名第二,WHO report，2013,全球结核病流行状况,WHO report，2013,全球结核病流行状况,全球结核死亡人数处于下降趋势 斯威士兰结核病感染率最高,WHO report，2013,全球结核病流行状况,Globally, an estimated 3.6% of new cases and 20.2% of previously tr

2、eated cases have MDR-TB There were an estimated 450,000 new cases of MDR-TB worldwide in 2012 On average, an estimated 9.6% of MDR-TB cases have XDR-TB,WHO report，2013,全球结核病流行状况,2012年全球新发结核病例为860万人，中国占总数的12% 在860万新病例中约110万人（13%）为HIV阳性，这些病例的75%在非洲 每年约有130万人死于结核病，我国为25万 结核病每24秒钟就杀死1人 预计未来20年还将有3600万人死

3、于结核病。 全球每年有45万新发MDR-TB，大约4.3万为 XDR-TB,“4多”,WHO report，2013,结核病诊治中存在的问题,预防问题,诊断问题,治疗问题,医疗问题,检验人员最关心的问题,根据不同分子水平及技术特点来选择诊断检测体系,方法选择,方法选择的影响因素,Sputum,涂片,MTB培养孵育4-8周 （阳性）,药敏试验观察 孵 育4周观察生长情况,涂片 （阳性）,分子诊断技术,液体培养及药敏试验,平均时间2-3个月,平均时间20天,只需2小时-2天,涂阳=60-98%有结核分枝杆菌，因此涂阳后最好用分子生物学方法进行快速鉴定,扩增 杂交,LAMP、SDA,芯片、RT-PC

4、R,SAT、TMA,FISH、Probe,分子诊断适宜技术的选择,T-SPOT.TB与 QFT-GI为IGRAs实验,结核菌素试验（TST）,T-SPOT.TB,QuantiFERON-TB Gold in-tube (QFT-GI),蛋白质水平,全血IFN-释放分析技术(IGRA),结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-）。因此，检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。 由于效应T细胞存活时间很短，而且具有特异性，因此可以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。 基于IGRA原理的产品目前已被美国、加

5、拿大、英国、德国、意大利、瑞士、法国、荷兰、日本等二十余个国家写入本国的结核诊疗指南中,-干扰素释放实验,酶联免疫斑点技术,培养滤液蛋白10（CFP 10）,早期抗原靶6（ESAT-6）,一、T-SPOT技术基础,T-SPOT,由结核杆菌基因组RD1区相同的操纵子编码的蛋白 所有的卡介苗（BCG）均丢失该基因序列 绝大多数的环境分枝杆菌也不存在RD1区,结核杆菌特异抗原,ESAT-6与CFP 10抗原,Plama PBMCs Gel Barrier Erythrocytes,检测过程,分离PBMCs,加入PBMCs与结核特异抗原 37孵育16-20小时,PBMCs 特异抗原,-干扰素抗体,加入

6、标记二抗，孵育1小时,加入显色液，终止反应,观察结果：1个斑点=1个效应T细胞,结果判断图,阴性结果,阳性结果,空白对照 抗原 A ESAT-6 抗原 B CFP10 阳性对照 （PHA）,潜伏性结核（LTBI）诊断技术比较,IGRAs与TST相比，具有更高的灵敏度和特异性 IGRAs与BCG, NTM无交叉反应，TST有交叉反应,难以从感染者中鉴别出活动性肺结核患者 小于5岁儿童、免疫力低下患者不适合采用IGRAs检测 试剂成本非常高,costs（费用） availability for clinicians and other health workers（医疗水平） patient ac

7、ceptability（患者是否接受） ease of distribution and storage（实验平台）,核酸扩增技术,SAT：Simultaneous Amplification and Testing (RNA仁度) CPA: Cross Priming Amplification (DNA/RNA,优思达) LAMP:Loop-Mediated Isothermal Amplification (DNA, Japan) TMA: Transcription Mediated Amplification (RNA, Gen-Probe),GenoType MTBDRplus：(

8、Hain Lifescience) NASBA: Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (RNA,OT) RCA: Rolling Circle Amplification (DNA, Molecular Staging) HDA：Helicase-Dependant Amplification (DNA, Biohelix, NEB),RNA 拷贝数 DNA拷贝数,生命力旺盛的病原体RNA转录活跃,较好的愈后指标,交叉污染少,TMA、SAT优点,RNA作为临床分子诊断靶标,二、SAT技术,同一温度下（42），以RNA为起始模板，通过M-MLV反转

9、录酶产生一个双链DNA拷贝，然后利用T7 RNA多聚酶从DNA拷贝上产生多个（1001000个）RNA拷贝；每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环；同时，带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，直观反映扩增循环情况,TB-SAT操作步骤,阳性结果,阴性结果,恒温扩增 -42C RNA 检测 -起始靶标与扩增产物都是RNA 扩增产物的污染更少 -RNA环境中易降解 更高的扩增效率-30分钟内扩增10亿倍 反应稳定 - 抑制物少,高灵敏度、特异性 活菌检测 操作简单、快速,MTBDRsl-鉴定XDR,MTBDRplus-鉴定MDR,MTB

10、C-鉴定MTB复合群,MTBCM-鉴定MTB和NTM,分类,Gene-Probe(TMA/Hain)技术,三、MTBC-鉴定MTB复合群(TMA技术),方法名称： HPV（Hybridization Protection Assay）-杂交保护分析法为Gen-probe公司专利 原理： 以rRNA为靶标，采用线性探针技术检测结核分枝杆菌复合群 检测设备： LEADER 50i HPA-MTD(Mycobacterium Tuberculosis Direct): 2.5h 报告，直接从标本中检测结核菌 HPA-Accuprobe: 1h 报告，用菌落或自动培养系统的菌,样本,细胞溶解,目标 r

11、-RNA释放,MTD技术路线,杂交体,rRNA,60C 15分钟,加入探针,探针,杂交,选择性试剂,60C,化学发光读数仪,荧光检测,MTD技术特点,MTD结核分枝杆菌检测技术特点,采用分子技术快速鉴定（2.5小时）结核分枝杆菌复合群 标本可以是涂片阴性或者阳性的痰标本；也可以是培养物 唯一获得FDA推荐的凃阴样本快速检测技术 检测RNA，RNA只能来源于活的细菌，可鉴定活动性结核病人） 采用TMA恒温扩增，不使用PCR仪器，无需专业的PCR实验室认证 HPA杂交保护分析技术：灵敏、特异 严格的实验室防污染技术：整个实验过程所有试剂和样本全部在同一个反应管内进行，杜绝交叉污染,MTD结核分枝杆

12、菌的直接检测意义,TB与其他分枝杆菌区分 AIDS患者鸟分枝杆菌小肠黏膜感染 龟分枝杆菌引起严重院内感染（南方某医院） 提高TB检出率 CSF、胸腹水等 疑似患者 长期低热、ESR持续增快，排除肿瘤和免疫性疾病患者，做血、痰TB菌MTD检测,DNA作为临床分子诊断靶标,四、MTBDRplus-鉴定MDR,方法名称： 耐多药结核病(MDR-TB)快速诊断为Hain Lifescience公司专利 原理： 采用线性探针技术（Line-Probe或称DNA-Strip）检测结核分枝杆菌复合群利福平(rpoB)和异烟肼(katG和inhA)等结核治疗药物的耐药基因来判断TB体内耐药性 MTBDRplu

13、s: 6h报告结核分枝杆菌复合群鉴定与耐药结果,结核耐药的分子机制,MTBDRplus技术路线,结果解释,野生型：有杂交带显色为“+”，表示未发生突变 耐药突变位点：有杂交带显色为“+”，表示发生突变 敏感：所有野生型探针“+”和所有耐药位点探针“-” 耐药：对应药物有1条野生型探针“-”或有1条耐药位点“+”,技术特点,MTBDRplus技术,MTBDRplus技术性能参数,J Clin Microbiol. 2010 Aug;45(8):2635-40. Epub 2007 May 30,MTBDRplus技术性能参数,中国人群存在一定数量的KatG S315N突变,WHO、盖茨基金会推荐

14、使用的快速线性探针技术，可以在6小时内给出药敏鉴定结果 可以做一线结核药物（异烟肼 利福平）、二线结核药物的耐药检测（乙胺丁醇、氟喹诺酮类药物、可注射结核药物） 标本可是涂片阳性的痰标本，或是培养物 技术步骤简单：核酸提取、PCR扩增、核酸杂交仪检测 每个试剂条上自带质控：CC杂交质控、AC扩增质控、TUB结核分枝杆菌质控，确保整个实验流程的可信度,HAIN-结核分枝杆菌耐药快速检测系统特点,五、交叉引物恒温扩增技术 (Cross Priming Amplification, CPA),本试剂盒将病原体DNA扩增、核酸杂交和核酸试纸条检测三种技术有机地融为一体，在恒温扩增反应中加入两对TB特异

15、性引物、一对特异性探针，同时一次性完成TB DNA的扩增及杂交过程，然后用3号一次性核酸检测装置对TB感染进行定性诊断，其检测灵敏度为10个病原体，高特异引物设计确保了结果的可靠性。由于待测样本的扩增（PCR管盖和石蜡油双重保护）和检测过程均在物理封闭条件下完成，所以本试剂盒具有防止实验室扩增物交叉污染，防止假阳性的效果,杭州优思达公司,CPA技术原理图,A:引入交叉引物位点,B:交叉引物扩增,C:检测产物,CPA技术路线图,有色颗粒,抗A抗体,双重标记的 特异性扩增物,阳性,抗抗体,试纸条检测结果判读原理图,结果的判读,阳性：试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区（C线），一条位于检测 区（

16、T线）且其强度L4（与附带的色卡比较）。表明样本中含有结核分枝杆菌，且其水平达到或超过本试剂盒的最低检出限 阴性：试纸条质控区（C线）出现一条红色条带，检测区（T线）没有条带或者其强度L4（与附带的色卡比较）。表明样本中不含结核分枝杆菌，或其水平低于本试剂盒的最低检出限 无效：试纸条质控区（C线）未出现条带。表明试剂盒已损坏、失效或者操作有误,恒温扩增-CPA,CPA的优势：快速，简单，灵活，稳定,Affordable 低价: 不需昂贵的设备和分子实验室,Sensitive 灵敏：10个菌/ml；与快培比较：87%,Specific 特异：能鉴别人型和牛型结核分枝杆菌,User-friendl

17、y 容易使用：不需PCR仪, 操作简单,Rapid/robust 快速/稳定：样本到结果2小时,Equipment -free 无仪器：仅需离心机、水浴锅或金属浴,Deliverable 易储运：不需冷链运输。装置可储存于室温,ASSURED,CPA技术性能参数,六、环介导恒温扩增技术 (Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP ),环介导恒温扩增法是日本荣研化学独立研发的一种“简便、快速、准确、廉价”的基因扩增方法。它的特征是针对目标DNA链上的六个区段设计四个不同的引物，然后再利用链置换反应在一定温度下进行反应。反应只需要把基因模板、引物、链置

18、换型DNA合成酶、基质等共同置于一定温度下（60-65）、经一个步骤即可完成。扩增效率极高，可在15min-1h内实现109-1010倍的扩增。而且由于有着高度的特异性，只需根据扩增反应产物的有无可对靶基因序列的存在与否作出判断,不需要使双链DNA先变性成单链 扩增反应在等温下可持续进行 扩增效率极高 针对六个区段使用两种不同的引物，可特异性扩增靶基因序列 仅使用一种链置换DNA聚合酶，成本低廉 扩增产物是在同一条DNA链上互补序列周而复始形成大小不一的结构 当模板是RNA时，仅需加入逆转录酶即可与DNA一样进行扩增,LAMP技术原理动画图,LAMP方法建立阶段所需的试剂,DNA 扩增 RNA

19、扩增,模板DNA 引物 FIP F3 BIP B3 BstDNA 聚合酶 dNTPs 反应缓冲液,模板RNA 引物 FIP F3 BIP B3 BstDNA 聚合酶 逆转录酶 dNTPs 反应缓冲液,LAMP技术结果判读原理图,LAMP法结果判断方式-目视检查混浊,LAMP法结果判断方式/-目视检查绿色荧光/浊度检测仪,扩增反应在等温条件（6065）下连续进行 可以使用简便、廉价的扩增装置 扩增效率高、可在短时间内完成扩增 可在短时间内得出结果 有非常高的特异性 可得出“扩增反应发生=有目的菌存在”的结论 产生大量扩增产物，检测方法简便 无需用电泳、特殊探针等，可通过浊度仪、荧光目视 方法确认

20、扩增结果 从扩增到检测可在1个反应试管内（封闭系统）完成 可防止由于扩增产物产生的污染 从RNA经一步反应可完成扩增 无需另外进行逆转录反应,小结,LAMP技术特点,LAMP技术的应用领域,食品领域 食物中毒致病菌的检测 食品的卫生管理 食物中毒的防止,临床领域 病原菌、病毒的检测及鉴定 通过SNP多态性分型决定用药量,农业领域 植物病害的早期发现及蔓延防止 转基因作物的检测,环境领域 环境、水中病原微生物的检测,工业领域 工业产品用大量DNA的生产成为可能,畜牧业领域 雌雄性别判断 病原微生物的检测 遗传病的发现,LAMP技术性能参数,七、DNA微阵列（基因芯片）技术,DNA微阵列或芯片技术是利用光导化学合成、照相平板印刷以及固相表面化学合成等技术，在固相表面合成成千上万个寡核苷酸探针，或将液相合成的探针由微阵列器或机器人点样于尼龙膜或硅片上，再与放射性同位素或荧光物标记的DNA或cDNA杂交，用于分析DNA突变及多态性、DNA测序、监测同一组织细胞在不同状态下多种组织细胞基因表达水平的差异、发现新的致病基