放射免疫法和ELISA之间的差别.ppt

1、放射免疫法和ELISA之间的差别,付涛（2012881007）,2020/8/8,浙江万里学院,放射免疫法,一、原理： 利用放射性同位素标记抗原或抗体，然后与被测的抗体或抗原结合，形成抗原抗体复合物的原理来进行分析的。,2020/8/8,浙江万里学院,分析方法,放射免疫法分析有两种方法： 竞争性RIA,又称传统RIA 非竞争性RIA，又称免疫放射分析（IRMA),2020/8/8,浙江万里学院,竞争性RIA,主要特点：标记的是抗原。其原理：未知抗原Ag+标记抗原Ag+已知定量抗体Ab标记抗原与抗体复合物AgAb+未知抗原与抗体复合物AgAb+游离标记抗原Ag（去除）。,2020/8/8,浙江万

2、里学院,基本原理,Ag-Ab + Ag,*Ag,Ab,Ag,+,+,*Ag-Ab + *Ag,(B) 复合物,(F) 游离物,*Ag与Ag的免疫活性相同 *AgAg Ab,Ag= * Ag , AgAb=*AgAb,Ag *Ag , *AgAb (B) *Ag(F),Ag *Ag , *AgAb (B) *Ag (F),2020/8/8,浙江万里学院,Ag,*Ag,Ab,*AgAb,AgAb,*Ag,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,2020/8/8,浙江万里学院,Ag,25,50,100,200,400,800,*Ag,Ab,分离B、F,B%=B

3、/(B+F),F%=F/(B+F),R=B/F,B1%,B2%,B3%,B4%,B5%,B6%,1,2,3,4,5,6,浓度,2020/8/8,浙江万里学院,B%,标 准 曲 线,2020/8/8,浙江万里学院,在体外条件下, Ag与定量的*Ag对限量的特异性Ab的竞争结合反应。,B%,F%,B/F,1.0,2.0,Calibration Curve,60,2020/8/8,浙江万里学院,（一）基本试剂,1、抗体,2、标记抗原,3、非标记抗原 （标准品）,二、基本方法,化学结构、免疫活性与被测抗原相同,高纯度,2020/8/8,浙江万里学院,1、抗体,1）亲合常数K （affinity con

4、stant K） 反应抗体与抗原的结合能力,2）交叉反应率 反应抗体的specificity,3）滴度 (titer) 抗体的稀释倍数,B/F,0.5,1.0,复合物浓度,1,2,3,斜率= -K,10,100,1000,10000,100000,Ab稀释度,工作滴度,高亲和力 高特异性 高滴度,Scatchard作图,2020/8/8,浙江万里学院,2、标记抗原,1）比活度和放化纯度足够高,比活度每微克抗原上标记放射性核素的千贝可数（KBq/g）,放化纯度具有免疫活性的标记抗原占总放射性的百分数。 90%,2）半衰期足够长,3）保持原有抗原的特性,125I大分子、3H or 125I小分子,

5、2020/8/8,浙江万里学院,（二） B和F的分离,1、第一类,2、第二类,双抗体沉淀法,PEG沉淀法,固相第二抗体法,二、基本方法,+,Ag,Ab(1),Ab(2),试管,Ab(2),Ab(1),Ag,可溶性复合物,可沉淀复合物,2020/8/8,浙江万里学院,三、质量控制（quality control）,1、精密度（precision） 变异系数（ CV ）,2、准确度（accuracy） 回收率=测定值/真实值100% 90%110%,3、灵敏度 （sensitivity） 方法的最小可测量,4、特异性（specificity） 交叉反应率,5、可靠性（validity） 平行性试验

6、,6、稳定性（stability） B0%，NSB，ED25，ED50，ED75,A,B,C,2020/8/8,浙江万里学院,RIA 小 结,灵敏度高 特异性好 精确的定量 方法操作简便,2020/8/8,浙江万里学院,非竞争性RIA（MISA),主要特点：标记的是抗体。按反应原理又分两种：单位点IRMA,其原理：抗原只有一个抗原决定簇，所测的抗原为小分子抗原。双位点IRMA：抗原有两个抗原决定簇，所使用的两种亚型抗体在与同一抗原分子结合时互不干扰。,2020/8/8,浙江万里学院,免疫放射分析法,*Ab,+,Ag-*Ab + *Ab,（immunoradiometric assay,IRMA

7、）,B%,Ag,（B）,（F）,2020/8/8,浙江万里学院,IRMA与RIA工作原理的主要区别,2020/8/8,浙江万里学院,ELISA,ELISA即酶联免疫吸附测定。 其基本原理有三条： （1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； （3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。,20

8、20/8/8,浙江万里学院,ELISA过程包括：抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）待测抗体（抗原）酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。,2020/8/8,浙江万里学院,ELISA常用的四种方法,1直接法测定抗原 1、将抗原吸附在载体表面； 2、加酶标抗体，形成抗原抗体复合物； 3、加底物。底物的降解量抗原量。 2间接法测定抗体 1、将抗原吸附于固相载体表面； 2、 加抗体, 形成抗原-抗体复合物； 3、加酶标抗体； 4、加底物

9、。 测定底物的降解量抗体量。,2020/8/8,浙江万里学院,间接法,洗涤,洗涤,洗涤,待测抗体,酶标抗抗体,2020/8/8,浙江万里学院,3.双抗体夹心法测定抗原 1、将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面; 2、加抗原，形成抗原-抗体复合物; 3、加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物; 4、加酶标抗抗体（第二种动物抗体的抗体）; 5、加底物。底物的降解量抗原量。,2020/8/8,浙江万里学院,双抗体夹心法,洗涤,洗涤,洗涤,待测抗原,2020/8/8,浙江万里学院,4. 竞争法测定抗原 （1）将抗体吸附在固相载体表面; （2）加入酶标抗原 （3）加入酶标抗原和待

10、测抗原； （4) 加底物。 对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。,2020/8/8,浙江万里学院,竞争法,洗涤,洗涤,待测抗原,酶标抗原,2020/8/8,浙江万里学院,ELISA实验步骤,2020/8/8,浙江万里学院,洗板步骤,每空加洗涤液 350ul，30秒 甩甩尽孔内液体，吸水纸上拍干 尽孔内液体，吸水纸上拍干 重复3次,2020/8/8,浙江万里学院,ELISA实验结果分析,标准品和标本的OD值减去空白孔的OD值 绘制标准曲线，查出标本浓度,2020/8/8,浙江万里学院,放射免疫法和ELISA之间的差别,1)放射免疫分析通过放射活性分子共价交联至抗体或抗原上，免疫反应后测定放射活性分子的放射信号来定量检测相应抗体或抗原等，可用于测定包括病毒、细菌、寄生虫、肿瘤以及小分子药物等的多种抗原和抗体。由于该方法特异性好，灵敏度高，,且仪器自动化，操作简便，样品制备简单等，因而自50年代末问世以来已在许多领域中得到广泛的应用。但该方法中操作人员需要接触放射性物质，会损害操作人员的身体，同时测定完成后放射性材料的处置也是个严重的问题。,2020/8/8,浙江万里学院,总结,2)酶免疫分析是将抗原、抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的一种免疫分析方法。将特定的酶标记在抗原或抗体上，在免疫反应后，通过肉眼观察或借助简单的光学仪器测定酶催化