体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证ppt课件.ppt

1、体内药物分析的样品处理和方法验证，1，1。为什么要处理生物样品？2.有什么生物样品吗？3.有什么样的样品处理方法？各自的特点。如何验证分析方法？5.什么参考标准？2，生物样品预处理的目的是在一剂进入体内后吸收、分布、代谢、体外排出。体液、组织、粪便中除了玻璃型(原型)药外，还存在多种形式，如药物的代谢物质、药物和蛋白质的结合物、药物或其代谢和内源性物质(如葡萄糖醛酸、硫酸形成的葡萄糖醛酸、硫酸酯化合物等)，分离后必须测定药物和代谢物质。3，1，处理的目的，2生物样品的介质组成比较复杂。血清中含有聚合物的蛋白质和低分子的糖、脂肪、元素等有机化合物、Na、K、Cl-等无机化合物。牙齿成分严重影响测

2、量的准确性和灵敏度，同时会污染仪器。因此，为了保护仪器，提高测量的灵敏度，确保测试结果的准确性和可靠性，必须字典处理样品。超过4，5，60%的能量和成本用于样品预处理，生物样品包含各种体液和组织，但实际上最常用的是比较容易获得的血液(全血、血浆、血清)、尿液、粪便、唾液。在某些情况下，使用牛奶、脑脊液等。6，2，生物样品的种类，全血不易保存，血细胞中含有更多的干涉物质，影响测量，因此很少用全血测量药物浓度。仅适用于血浆药物浓度过低或血浆药物浓度波动严重且难以控制的药物(如环孢素A)。7，1全血，血液中药物浓度的测定一般是指血浆或血清中的药物浓度，而不是含血细胞全血中的药物浓度。将提取的血液放入

3、包含抗凝剂(如肝素、EDTA)的试管中搅拌后，3000 4000 r/min离心机、血细胞分离、上清液为血浆。8，2血浆，9，血浆中所含物质的种类和比例，血清在采血后不加抗凝剂，在室温下定15-30 min，自然凝结后，分离原深海上清液。血清颜色比血浆浅，成分比血浆纤维大部分少，易于处理，血浆和血清的药物浓度测定值通常相同。10，3血清，一般当药物在体内达到稳定状态时，血浆中的药物浓度与作用点的浓度密切相关，即血浆中的药物浓度反映了体内(靶器官)的状态，因此血浆浓度可以用作作用部位药物浓度的可靠指标。血浆和血清可以稳定冷冻保存，一般储存在-20的条件下，在保存器官时可以保存在-80的条件下，是

4、生物样品检验中最常用的样品。11，尿液的主要成分是水，元素，无机盐类。采集尿液样本后，为了保存，经常放防腐剂。体内药物去除主要通过尿液排出，药物可以通过圆形或代谢，其合物等排出。尿液的药物浓度高，但尿液浓度受尿液量的影响，通常变化很大，所以要测量一段时间内排出尿液的药物总量。12，4尿，唾液中所含的成分比较简单容易得到，但只有少数药物的唾液浓度和血浆玻璃药物浓度相关，实际使用不多。药物血浆结合率高时唾液中药物的浓度很低，很难检测。13，5唾液，取样后，除了立即分析外，为了防止药物的变化，还要进行短期保存。4可以冷藏。保留器官，但-20冷冻，不要重复董洁融化，必要时可以添加酶抑制剂和抗氧化剂。1

5、4、生物样品的保存：主要应考虑生物样品的种类、所测药物的性质和测定方法三个茄子方面。15，3，常用处理方法，1。沉淀蛋白PPT 2。液体萃取LLE 3 .固相萃取SPE，16，1。沉淀蛋白、有机溶剂沉淀法可以添加水溶性的有机溶剂，引起蛋白质的分子内及分子间氢键变化，从而凝聚蛋白质。常用有机溶剂包括乙精、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。血浆、血清和有机溶剂的体积比为133603时，可以去除90%以上的蛋白质，使用低温高速离心机16000r/min离心10min可以完全沉淀出的蛋白质。在实际应用中，大部分采用50uL的血浆，添加500uL的有机溶剂，离心涡流后，取清样品。沉淀后，如果信号相应不

6、好，更换尝试有机溶剂或沉淀时加入酸或碱，调整pH值会对结果产生很大影响。常用的酸碱：盐酸、甲酸、乙酸、氨水等。17，优点：操作简单，是方法开发中首先要考虑的。缺点：仅用于样品中浓度高的药物测定。处理后，样品中仍然有很多干涉物质，妨碍了结果。剩下的杂质能防止色宝热，污染机构。18，中性盐可以替换蛋白质和水合的水，使蛋白质脱水沉淀。常用的中性盐：饱和硫酸胺、硫酸钠、镁盐、磷酸盐、柠檬酸盐等。盐析法经常与有机溶剂萃取法结合使用，药物回收率高。加入中性盐，19，20，20，然后加入强酸。当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子的形式存在，添加强酸后，蛋白质阳离子和不溶性盐形成沉淀。常用的强酸是10%

7、三氯乙酸等。血清和强酸的比例为1:0.6牙齿混合，可以用高速离心力去除蛋白质。在酸性中分解的药不要用牙齿方法去除蛋白质。当PH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子和蛋白质分子中带有负电荷的羧基形成不溶性盐沉淀。常用的沉淀剂包括CuS04-Na2W04、ZnS04-NaOH等。含药血清和沉淀剂的比例为1:2混合，可获得高速离心、分离后的清液。21，添加锌盐或铜盐沉淀剂，测定部分酸性不稳定和蛋白质结合药物时，经常使用酶解法。在测定尿液的药物浓度时，尿液中的药物主要以结合物的形式排除，所以比原药极性大，不容易被有机溶剂提取，一般使用酶水解法。22，酶解法，超速离心法平衡透析法最重要的应用是测定血浆中游离

8、的药物浓度和药物的血浆蛋白结合率。23，去除蛋白质的其他方法：由于药物在体内被吸收，必须通过膜运输，所以大部分药物具有一定的脂溶性，生物样品中的内源性杂质大部分是强极性的水溶性物质，因此，根据药物分子和底物之间极性的差异，可以使用适当的有机溶剂提取药物，有机溶剂提取可以一次清除大部分杂质。24，2。液萃取法LLE，有机溶剂应选择稳定，挥发，低毒性，不与水相混合的溶剂。常用有机溶剂包括乙醚、乙酸乙酯、正己烷、叔丁基甲醚、氯仿等。应用本法时，应考虑所选有机溶剂的特性、药物的特性、有机溶剂奖、获奖体积比、获奖pH值等。酸性药物的解离：AH2OA-H碱性药物的解离：B H2O B OH-药物的解离常数

9、pKa是药物在50%释放时溶液的pH值。25，药的提取程度主要取决于获奖的pH值。对于碱性药物，最佳pH值高于pKa 1-2单位。对于酸性药物，低于pKa值1-2个单位。这样，90%的药物以非温和的形式存在，更容易溶解在有机溶剂中。经常用于调节PH值的物质有甲酸、乙酸、盐酸或氨水、氢氧化钠等。影响水相PH值-液萃取的最重要因素，26，具体萃取模式有直接萃取法和反萃取法。优点：样品提取后，可以去除大部分杂质，比较“干净”。有机溶剂蒸发后再溶解，可以浓缩样品。大部分药物具有脂溶性，适用范围很广。缺点：时间和努力，繁琐的操作；然后提取血浆，血浆的脂质一起提取，使用质谱探测器时离子源产生基质效应，严重

10、阻碍了质谱检查结果的准确性！27，在方法探索中，一般判断上述溶剂、并行操作、同时提取、额外空白对比、比较结果，确定哪种有机溶剂的提取效果最好。如果没有理想，则可以再次混合上述溶剂，调整1:1、1:2、1:3的使用。在寻求合适的提取溶剂的过程中，可以根据药物的酸碱性添加试剂、碱或离子，以提高回收率。在提取过程中，必须严格控制pH值，对于阳性药品，应使用缓冲溶液保证可靠地再现回收率。28，29，如雌二醇检查血浆样本100uL，同位素内标准20uL，甲酸50uL，n-己烷1mL叔丁基甲醚3mL，旋涡振动10min，3000r/min离心10min，-。固相萃取(Solid Phase Extract

11、ion，SPE)是80年代中期开始发展的样品预处理技术。由液固萃取与液相色谱技术相结合开发。主要通过固相填料，对样品组进行了选择性吸、解吸过程，实现了样品的分离、纯化和财富。主要目的是减少样品基质的干扰，提高检测灵敏度。30，3。固相萃取SPE，固相萃取的基本原理和方法：SPE技术基于液-固色频谱理论，通过选择性吸附、选择性洗涤富集、分离、纯化样品，是包括液相和固相的物理萃取过程。也可以将其看作是一个大致的颜色频谱过程。更常见的方法是通过液体样品吸附剂保存其中测定的物质，用适当的强度溶剂去除杂质，然后用少量的洋溶剂冲洗测定的物质，快速分离净化和浓缩。也可以有选择地吸附杂质，使被测试的物质流出。

12、31，32，33，提取小支柱，一次性使用，防止交叉污染！固相萃取作业一般分5个阶段：甲醇/乙腈湿润小柱活化，填料活化；平衡的水或合适的缓冲液洗涤平衡柱；将样品移到柱子上，抽出废液。使用浸出液或缓冲液最大限度地清洗障碍物。用洗脱用小溶剂测定的物质冲洗和收集。34，1。情色补正原理2。反色补正原理3。根据离子交换原理，35，原理分类：36，37，SPE方法的优点：1。不会发生油画。2.覆盖面广。萃取效率高。4.方便、快速，可以一次提取和分离多个化合物。溶剂消耗低。自动化很容易。7.离子交换固相萃取利用离子交换原理，与频谱柱的极性大小分离原理不同，配合使用可以最大限度地分离药物，消除干扰。目前商品化

13、的固相萃取小柱(cartridge)已得到广泛应用。38，3种茄子方法的比较：将药物化学衍生化的目的是使药物具有可分离的性质。提高测试的灵敏度。提高药物的稳定性。提高对映异构分离能力等。药物分子中含有活跃H的人都可以从化学上导出。例如，-COOH、-OH、-NH2、-NH-、-SH等官能团的药物都可以导出。39，4。化学衍生化方法，HPLC的化学衍生化方法(包括柱前衍生化和柱后衍生化)，在柱前衍生化分析之前，尽可能提取和分离药物，然后衍生，以防止含有相同功能团的其他杂质影响分离。柱后衍生化通过频谱柱在药物分离后进行，从而在探测器上形成高灵敏度的衍生物。HPLC法中常用的诱导化试剂(PLC)包括

14、邻苯二甲醛、甜酒酰氯、荧光胺等。，40，41，定量下限达到10 pg级！测试中药物的理化性质及体内存在状态分析测定的目的和生物样品类型及预处理方法实验室条件，42、建立体内药物分析方法，1 .频谱分析2。色谱法3。毛细管电泳法4。免疫分析5。同位素方法，43，体内药物分析方法大体可以分为几个茄子类别：使用44标准产品扫描质谱条件。3.选择颜色频谱柱和流动相，探索适当的液相条件。4.根据样品基质配方模拟生物样品，选择相应的样品处理方法，处理落后样品分析。5.调整样品处理方法或液相条件，添加质谱参数最优化6。根据检查目的设定定量范围，并考察方法。方法验证，生物样品测量的核心是方法验证。方法确认是整

15、个药代动力学研究的基础。这是药代动力学研究与其他药理毒性研究不同的特别之处。所有药代动力学研究结果都依赖于生物样品的测定，只有可靠的方法才能得到可靠的结果，因此必须验证已建立的方法。此外，在实际样品检验过程中，必须进行方法质量控制，准备伴随标准曲线，测量品质管制样品，确保测试方法的可靠性。45，46，47，guideline on bio analytical method validation-EMEA，48，49，50，4。补偿曲线Calibration curve每个浓度点的准确度必须在85%到115%之间，精度必须低于15%，定量下限必须在80%到120%之间，以及20%。对于不符合要求的浓度点，可以排除计算，但至少75%的浓度点符合要求。方法验证期间，统计应至少包括三条合格的标准曲线。51，52，品质管制样品质量控制，QC，低浓度品质管制(Low QC)浓度不超过LLOQ的3倍。中等浓度品质管制浓度通常是定量范围的中等浓度。高浓度品质管制浓度超过ULOQ的75%。品质管制样品建议独立人员一次配制，通过样品分析后，分材、冷冻保管，每次取用足够数量的样品，其余的作废。53，54，55，8。稳定性稳定性稳定性、8.1分析物和耐表标准储备(Stock)和标准工作液(Working)