课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 (2)

1、课 题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,引言：,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,思考1：为何细菌能将尿素分解成氨？,土壤中的细菌能合成催化分解尿素的脲酶,芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。,思考3： 怎样从土壤中分离出能够分解尿素的细菌？,怎样统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌？,思考2：土壤中有哪些细菌能分解尿素？,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,（一）筛选菌株方法：,使用以尿素为唯一N源的选择培

2、养基筛选。,一、基础知识：,分离分解尿素细菌的选择培养基配方,将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000ml。,1、显微镜直接计数：,利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,（二）统计菌落数目方法：,（1）不能区分死菌与活菌； （2）不适于对运动细菌的计数； （3）个体小的细菌在显微镜下难以统计计数；,缺点：,2.间接计数法：,稀释涂布平板统计。,（2）同一稀释度下，应涂布三个或三个以上的涂布平板。,（1）分离不同微生物要有不同的稀释度： 细菌一般为104，105，106 。 放线菌一般为103，104，105。 真菌一般为102，103，104。,（3）培养时，还应设置一

3、个空白平板和三个涂布平板一起培养。目的：前者是为了检测培养基是否被污染或者灭菌是否彻底；后者是为了增强实验的说服力与准确性。,（4）统计计数时：为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数，并要计算出某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。,每克样品中的菌落数(CV)M 其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(m)；M代表稀释倍数。,（5）每克样品中的菌落数的计算公式：,统计的菌落往往比活菌的实际数目低。因为当两个或多个活菌重叠生长时，平板上只观察到一个菌落。,（6）稀释涂布平板统计法的特点：,二.实验操作 1、土壤取样 选择肥沃、湿润的土

4、壤，先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好信封中。 取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。 2、制备培养基： 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。,在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,应采用104，105，106三种不同的稀释度,3、样品的稀释,应在火焰旁称取土壤10g。,4、取样涂布,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明稀释操作不精确，需要重新实验。,同一稀释度下，应涂布三个或三个以上的平板。,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,5、微生物的培养与观察,（1）培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：3037培养12d 放线菌：2528培养57d 霉菌：2528的温度下培养34d。,（2）在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。并选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,三.结果分析与评价： 四.课外延伸 在