蛋白质的表达纯化.ppt

1、实验8:蛋白质的表达、分离、纯化和鉴定。(1)了解重组蛋白表达的方法和意义。(2)了解亲和层析分离纯化的方法。实验原理克隆基因在细胞中的表达对理论研究和实验应用都有重要意义。通过表达，我们可以探索和研究基因的功能和基因表达调控的机制。同时，我们可以克隆基因并表达编码的蛋白质，用于结构和功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其外源基因产物的表达水平远远高于其他基因表达系统，目标蛋白的表达量甚至可以超过细菌总蛋白的80%。在本实验中，在37，IPTG的诱导下，具有六个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白在大肠杆菌BL21中过表达。蛋白质可以通过色谱介质纯化，其中镍离子(Ni2)

2、通过共价偶联的腈三乙酸固定(NTA)，这实际上是金属亲和色谱(MCAC)。蛋白质的纯化程度可用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。材料和试剂，试剂1磅液体培养基：trytone 10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，与蒸馏水混合至1000毫升。2氨苄青霉素：100毫克/毫升3加载缓冲液(glb):100毫米nah2po4，10毫米tris，8毫米尿素，10毫米m-me，ph8.04洗涤缓冲液(UWB):100毫米nah2po4，10毫米tris，8毫米尿素，ph6.3 5洗脱缓冲液(洗脱): 100毫米nah2po4，10毫米tris，8毫米尿素，500毫米咪唑，pH8.0 6 IPTG，实验步骤：1。重

3、组氯霉素酰基转移酶蛋白1的诱导。将含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白大肠杆菌BL21菌株接种在5mL LB液体培养基(含100微克/毫升氨苄青霉素)中，在37振荡培养过夜。2.将1毫升过夜培养物转移至100毫升(含100微克/毫升氨苄青霉素)LB液体培养基中，在37振荡培养至OD600=0.6-0.8。取10ul样品进行SDS-PAGE分析。3.加入IPTG至最终浓度为0.5毫摩尔/升，在37继续培养1-3小时。4.12，000转/分，离心10分钟，弃去上清液，并将细菌沉淀物储存在-20或-70的冰箱中。氯霉素酰基转移酶重组蛋白1的分离纯化。重组蛋白的变性和裂解：将50毫升细菌沉淀物在冰浴中冷冻-解

4、冻，加入5毫升装载缓冲液GLB，用吸管重新悬浮，以412000转/分钟离心30分钟，将上清液(总蛋白细胞裂解物)吸入干净的容器中并丢弃沉淀物。2.NTA色谱柱的制备：向色谱柱中加入1毫升NTA介质，分别用8毫升去离子水和8毫升加载缓冲液GLB洗涤。(将速度调整0.5毫升/3分钟)。3.将3毫升细胞裂解物以10-15毫升/小时的流速置于Ni2 -NTA柱上，收集流出液。外源蛋白的洗脱：以10-15毫升/小时的流速用50毫升洗涤缓冲液超宽带洗涤柱子，在洗涤开始和结束时取10微升样品进行SDS-PAGE分析。5.洗脱目标蛋白：用10毫升洗脱缓冲液洗涤柱，每管0.51毫升，收集610管，取10微升样品

5、进行SDS-PAGE分析。组装玻璃板用于制胶(由助教演示)。2.分离胶的制备：根据所需浓度制备12.5分离胶。填充分离胶后，小心加水密封胶面(注意不要损坏胶面)，胶自然凝固后(此时，胶面和水封之间可以看到清晰的边界)，3。配制浓缩胶：按要求的浓度配制4%的浓缩胶，配方如下：4。加入浓胶，插入梳子。浓缩凝胶自然凝固后，将装置放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，小心拔出梳子。如果拔出梳子后加样孔之间的间隔变形，可以用注射器针头小心地排列。5加样：取大肠杆菌和牛血清白蛋白样品，每个孔不要加太多样品。通常，在每个孔中加入10L样品。6电泳：先将电压保持在80V，待样品进入分离凝胶后，再将电压调至120V(恒

6、压)。当溴酚蓝移动到离底部约0.5厘米时，电泳停止。打开玻璃板，切断浓缩胶，剥离凝胶，准备染色。8凝胶染色：考马斯亮蓝R250染色。两片胶水(小盒子)或四个馅饼用清水冲洗，用脱色液(25%乙醇，75%乙酸)脱色，用量和步骤与染色相同，脱色两次，每次10分钟。注意事项(1) Acr和Bis是神经毒剂，对皮肤有刺激性，因此操作时应戴手套和口罩。(2)玻璃板表面应光滑干净，否则在电泳过程中凝胶板和玻璃板之间会产生气泡。(3)样品槽模板的梳齿应光滑平整。(4)填充凝胶时不应有气泡，以免影响电泳时的电流通过。(5)不要破坏取样槽底部的平整度，以免电泳后区域变形。(6)电泳应选择合适的电流和电压，过高或过

7、低都会影响电泳效果。(7)将5DS/电泳缓冲液稀释至1倍浓度，并将其倒入电泳槽中，该槽需要800毫升。1。将红色玻璃夹的底部放下，以直角打开卡口，放入两片厚玻璃，薄玻璃面向自己。注意厚玻璃箭头朝上，它旁边的两个小玻璃条与薄玻璃接触形成一个缝隙。2.放下玻璃并夹在平坦的桌面上，使玻璃和夹子的底面完全对齐，向外拉塑料卡口并紧紧地关闭夹子。3。将完成的玻璃夹放在制胶架上，注意薄玻璃面向自己，厚玻璃上的箭头朝上。按下弹簧夹，将玻璃夹夹入制胶框。用胶水填满玻璃的缝隙，在上面放一把梳子，等胶水凝固。4。取出准备好的玻璃(带粘合剂)，并将其放入电极夹(夹在底面的卡口上)。注意薄玻璃面向电极座，厚玻璃的箭头朝上，玻璃和红色橡胶条必须完全贴合。(两片准备好的胶水应该同时放在一起。如果只使用一块，另一面应由提供的塑料板代替。注意塑料板的尖端，使塑料板和橡胶条完全贴在一起。正常安装将形成一个封闭的容器。5