动物生物反应器.ppt

1、动物生物反应器,一般把目的片段在器官或组织中表达的转基因动物叫动物生物反应器（bioreactor），几乎任何有生命的器官、组织或其中一部分都可经过人为驯化为生物反应器,从生产的角度考虑，生物反应器选择的组织和器官要方便产物的获得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此发展了动物乳腺生物反应器,动物血液生物反应器和动物膀胱生物反应器等。其中，转基因动物乳腺生物反应器是目前国际上唯一证明可以达到商业化生产水平的生物反应器。,动物就像一个活的发酵罐，其温度、气体、水分和PH值均由动物自身调控，所以常被喻为药物工厂、生物反应器、基因农场或分子农场。 动物生物反应器优点： 表达产物能充分被修饰且具有稳定的生物

2、活性。 产品成本低。可无限繁殖，且饲养成本低，可大规模生产。 产品质量高，易提纯。由动物生物反应器生产的药品为纯的生物制品，避免了化学试剂及生物毒素的污染，安全可靠。 生物反应器目的基因对动物内部组织器官的干扰和影响不大，一旦获得有高效表达的祖代个体，其遗传性即可保证维持生产的低成本。,2010年5月20日：世界首个人造生命“辛西娅” 选取一种名为丝状支原体的细菌，对其基因组进行解码并复制，产生人造的合成基因组。然后将人造基因组移植入另一种称为山羊支原体的细菌，细菌为人造基因所控制，合成细菌分裂等行为就像天然细菌一样。,春蚕到死丝方尽，蜡炬成灰泪始干。,蚕的一生经过蚕卵蚁蚕熟蚕蚕茧蚕蛾，共四十

3、多天的时间,家蚕生物反应器,将特定的重组昆虫杆状病毒（基因）植入家蚕的蚕蛹体内，生成对人类有用的生物活性物质（如生物药品、生物疫苗、保健食品等）。,例如：把人胶原蛋白的 基因植入蚕的细胞里， 培育出绢丝腺分泌人胶 原蛋白的转基因蚕。,牛：吃的是草，挤出的是奶,转基因牛 ：吃的是草，挤出的是药！,1980年，Gordon等人首先 育成转生长素基因小鼠。 世界第一个转基因动物。 生长速度快24倍、体形 大一倍的转基因”硕鼠”。 发表在1982年的nature杂 志上。,1987年Gordon 等将组织型纤溶酶原激活剂(tPA) 与小鼠乳清酸蛋白(WAP)基因的启动子构成重组 基因，成功地培育出了3

4、7只在乳汁中能表达tPA 的转基因小鼠。,2006年6月2日，世界上第一个利用转基因动物乳 腺生物反应器生产的基因工程蛋白药物重组 人抗凝血酶（商品名：ATryn ）上市获得批 准。,目前，1-抗胰蛋白酶(AAT)、人乳球蛋白、凝 血因子III、IV、VIII、纤维蛋白原、降钙素、 SOD、红细胞生成素、IGF-1等成功表达，多种药 用蛋白已经进入临床试验阶段。,上海交通大学医学遗传研究所：,（1）1998年中国首头转基因羊。乳汁中表达人凝血因子IX 蛋白。人凝血因子IX是治疗血友病的药物。,（2）1999年，带有人血清白蛋白基因的转基因试管 牛“滔滔”降生。,tPA,第一个哺乳动物细胞表达生

5、产的医用蛋白是人组织纤溶酶原激活剂（Tissue plasminogen activator，tPA）。,将人的tPA cDNA克隆在含有强启动子和终止子的表达载体上，转染dhfr（二氢叶酸还原酶）细胞，用氨基蝶呤处理培养，tPA随着dhfr基因大量扩增，新筛选出的转化株进行大规模培养高水平生产人的重组tPA。,动物乳腺生物反应器 动物乳腺生物反应器用重组DNA技术和转基因技术将目的基因转移到尚处于原核阶段（1，2细胞的受精卵）的动物胚胎中，经胚胎移植得到转基因乳腺表达的个体。 常利用哺乳动物乳腺特异性表达的启动子元件和目的基因构建转基因, 启动子能指导外源基因在乳腺中表达, 最终从转基因动物

6、的乳液中获取重组蛋白。,1. 动物乳腺生物反应器的制备,（1）表达载体的构建 目前用于表达载体的启动子调控元件选用动物乳蛋白基因启动子元件，主要有四类乳腺定位表达调控元件： 第一类是-乳球蛋白(-lactoglobulin)(BLG)基因调控序列， 第二类是酪蛋白基因调控序列： 第三类是乳清酸蛋白(WAP)基因调控序列； 第四类是乳清白蛋白基因调控序列。,（2）目的基因的选择 选择目的基因的基本要求是，正常情况下浓度低、翻译后修饰复杂、其它表达体系难以表达或表达量低、应用前景广阔的蛋白基因。,（3）体外重组及检测 选择好目的基因和启动子调控元件后进行体外重组，构建融合基因。并将构建的表达载体转

7、染至动物乳腺细胞中表达，提取细胞分泌蛋白，检测目的基因表达情况。,（4）基因转导 将构建好的重组基因用显微注射等基因转导方法转移到受精卵。,（5）胚胎移植 利用胚胎移植技术将制备的转基因受精卵植入待孕母体子宫内，生产转基因动物，得到转基因乳腺表达个体。通过采集转基因动物的乳汁,来获得目的基因表达产物。,（6）鉴定 转基因动物乳腺生物反应器可以从分子水平和乳腺分泌物两个方面进行鉴定。,目的基因的鉴定：检查动物体内是否有外源基因的存在，以判明是否是转基因动物。可用聚合酶链反应(PCR)、斑点杂交(Dotbloting), Southern印迹分析等多种方法进行检测。,目的蛋白的鉴定：建立动物乳腺生

8、物反应器的最终目的是得到有活性的外源蛋白，因此，对目的蛋白的检测非常重要。检测方法主要有： (1) SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE) (2) 酶联免疫吸附实验(ELISA) (3) Western印迹分析,乳腺动物反应器建立的关键在于： 乳腺组织特异性表达载体构建的合理性和有效性，这包括外源基因在活体动物组织中分泌表达，表达是否具有组织特异性，表达水平及其蛋白是否具有全部的生物学活性。,为解决这些问题，国外采用的的方法： 采用BLG、WAP、酪蛋白启动子及部分内含子等乳腺定位表达调控元件进行乳腺特异性表达的调控。 采用基因组DNA或小基因替代cDNA,以提高基因表达水平。 采用YAC携

9、带大容量的外源基因和侧翼顺序，消除基因的位置效应。 采用定点整合法，将外源基因定点整合到乳腺特异表达区域，或处在启动子下。 乳腺组织特异性表达载体作为一种重要生物元件，受知识产权保护，如英国的PPL公司拥有BLG的专利，美国Genyme公司申请了-casein的专利等,2. 动物乳腺生物反应器的优点,1）生物学活性和功能与天然蛋白完全相同（经过充 分的修饰加工，具有稳定的生物活性）。,2）对动物的生理影响较小（乳腺是一个外分泌器官 ，乳汁不进入体内循环。,3）表达产量高、表达产物的提纯相对容易、生产成 本相对较低。,4)表达产品的安全性好。,3. 动物乳腺生物反应器的应用,高营养价值乳汁 生产

10、药用蛋白,在山羊奶中生产ATT,例：中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达制备促 红细胞生成素（erythropoietin,EPO）,红细胞,血液是存在于心血管系统内的流动组织，它包括细胞 （血细胞）和液体（血浆）两部分。,血细胞分为：红细胞、白细胞和血小板。,红细胞又称红血球，是血细胞中数量最多的一种。红细 胞中含有一种重要的蛋白质为血红蛋白，红细胞的主要 功能是由血红蛋白完成的。,（1）血液的运输功能主要是靠红细胞来完成的：运输O2 和CO2。,（2）缓冲酸碱度(血浆pH值: 7.357.45)。,（3）血液中红细胞数量，血红蛋白浓度低于正常时发生 贫血，影响了血液运输功能，出现一系列的病理变化

11、。,促红细胞生成素EPO,（1）定义与特点,红细胞生成素（erythropoietin ,EPO）,人体中的促红细胞生成素是由肾脏和肝脏分泌的一 种激素样物质，为分子量67万的糖蛋白。,药用价值：能够促进红细胞生成。服用红细胞生成 素可以使患肾病贫血的病人增加血流比溶度（即增 加血液中红细胞百分比）。,促红细胞生长素（）属于基因兴奋剂，可 以增加人体内的红细胞数量，从而使肌肉获得更 好的氧供，增强运动员的耐力。,但是长期使用可使人体血液粘稠，增加心脏负 担，导致血液凝固、血栓等心血管疾病，甚至死 亡。,在2005年2月份的神经科学杂志上，西班牙 医生公布了一个病例，一位职业自行车运动员在 经常

12、使用含有EPO的药物之后发生脑血管栓塞。,兴奋剂,文献讨论1,生产EPO的CHO工程细胞,电激法,脂质体法,宿主细胞：,CHO：中国仓鼠卵巢分离的细胞,CHO-dhfr-细胞（二氢叶酸还原酶缺陷型）：缺失,DHFR的CHO细胞不能合成四氢叶酸，只能在添加 胸苷、甘氨酸和嘌呤的培养液上生长。,增加氨基蝶呤的浓度，可提高与dhfr基因相连的外 源基因的表达水平。,4. 动物乳腺生物反应器存在的问题 （1）外源基因在动物体内的位点整合问题 （2）乳蛋白基因表达组织特异性问题 （3）转基因表达产物的分离和纯化问题 （4）转基因的技术与方法问题 （5）伦理道德问题,动物血液生物反应器,外源基因在血液中表达的转基因动物叫血液生物反应器。大家畜的血液容量较大,利用动物血液生产某些蛋白质或多肽等药物己取得了一