第六章 微生物的生长及其控制(刘).ppt

1、第六章 微生物的生长繁殖及其控制,生长微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化作用异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过程。 繁殖生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。 个体生长微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢，原生质与细胞组分的增加为个体生长。 群体生长群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、密度或浓度来衡量。（由于微生物的个体极小，所以常用群体生长来反映个体生长的状况）个体生长个体繁殖 群体生长 群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖,生长与繁殖的概念,微 生 物 学,北方民族大学,6.1微生物生长的研究方法 6.1.1微

2、生物的培养 6.1.2微生物的同步生长及同步培养法 6.1.3微生物生长的测定 6.2微生物的群体生长规律 6.2.1典型生长曲线 6.2.2几个重要参数 6.2.3连续培养 6.3环境因素对微生物生长的影响 6.4微生物生长的控制,本章内容,微 生 物 学,北方民族大学,6.1 微生物生长的研究方法,一、微生物的纯培养及获得方法,稀释平板涂布分离法 稀释倒平板法 平板划线分离法 液体稀释法 单细胞（单孢子）分离法,常用分离、纯化微生物方法,6.1.1微生物的培养,为了进行纯培养，防止其它微生物的进入是很重要的，若其它微生物进入了纯培养中，便称之为污染。,北方民族大学,微 生 物 学,微 生

3、物 学,平板涂布分离法（Spread Plate）,先用固体培养基制成无菌平板,然后将一定稀释度的少量样品(一般是0.2_0.5ml)加到平板上,并用无菌玻璃涂棒将菌液均匀涂布到整个平板表面,经过培养后挑取单个菌落. 是最常用的方法.,简单易行，但易造成机械损伤,将待分离的材料用无菌生理盐水进行一系列稀释,然后取不同稀释液少许(一般是1ml)分别与已熔化并冷却到50左右的琼脂培养基混合倒入无菌平皿中,冷凝后进行培养.如果稀释得当,在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落,这样的菌落可能是由一个细胞繁殖而来的.随后挑取该单个菌落,或重复以上操作数次,就可得到纯培养.,稀释倒平板法（Pour

4、 Plate）,北方民族大学,微 生 物 学,用接种环以菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线 ，如果划线适宜，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。,平板划线分离法,微 生 物 学,平板划线分离法,特点：快速、方便。 分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品）,微 生 物 学,首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使一支试管中分配不到一个微生物.如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物. 这种方法适合于细胞较大

5、的微生物.,液体稀释法,微 生 物 学,单细胞（单孢子）分离法,采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。 毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。 显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。 小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。,微 生 物 学,选择性培养分离法,为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。,利用选择培养基进行直接分离 富集培养,微 生 物 学,

6、试从相应样品中分离特定的微生物：,从土壤中分离褐球固氮菌,从酒样中分离酵母菌,从霉腐样品（水果、馒头、面包等）中分离霉菌,从土样中分离放线菌,试从实验目的、原理、实验方法（包括确定采集样地点、分离纯培养物方法、何种培养基等）、步骤及时间安排等几个方面设计分离相应的菌种。,二、微生物的培养方法,好氧培养,固体培养,实验室用琼脂作凝固剂,工业生产中则利用含水量适度的半固体物料作为培养基,液体培养,实验室中主要采用摇瓶培养法,工业上主要采用深层液体通气法,厌氧培养,实验室中（不管是液体厌氧培养还是固体厌氧培养）都需要特殊的培养装置,工业上主要采用液体静置培养方法,微 生 物 学,6.1.2微生物的同

7、步生长及同步培养方法,同步生长的概念：在培养物中所有微生物细胞都处于同一生长阶段，并都能同时分裂的状态，称为同步生长。进行同步分裂的细胞称为同步细胞。,由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在着技术上的困难。,同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相，彼此间形态、生化特征都很一致，因而是细胞学、生理学和生物化学等研究的良好材料。,同步培养法：能获得处于同一生长阶段的群体细胞的培养方法。,获得同步生长的方法（同步培养的方法）：,离心分离法,过滤分离法,硝酸纤维素滤膜法,获得同步生长的方法主要有两类： 环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。造成与正常细胞周期不同的周期变化。 机械法：选

8、择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。,机械法,硝酸纤维素滤膜 法：,原理：一些细菌细胞会紧紧粘附于硝酸纤维微孔滤膜上。 步骤：菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；反置滤膜，以新鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞，即为同步培养。,微 生 物 学,评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果；,客观地反映微生物生长的规律；,评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；,微生物生长的测定,6.1.3微生物生长的测定方法,微生物的生长繁殖及其控制,描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况，需选用不同的测定指标。,一、微生物细胞

9、数目的测定法,直接法,血球计数板,涂片计数法,间接法,涂布平板法和倾倒平板技术,膜过滤法,（活菌计数法）,（死、活菌不分）,比浊法,微生物的生长繁殖及其控制,血细胞计数板,直接法血球计数板法,采用细菌计数板或血球计数板，显微镜下直接计数 （计算一定容积里样品中微生物的数量）。,缺点： 不能区分死菌与活菌； 需要相对高的细菌浓度.,用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。血细胞计数板是一块特制的厚载玻片，其上由四条槽构成三个平台，中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格即为计数室。,大格 （计数室）,血细胞计

10、数板,计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，每个中方格又分成25个小格（即16x25），另一种是一个大方格分成25个中方格，每个中方格又分为16个小方格（即2516）。,1大格=16中格 =16 X 25小格 =400小格,1大格=25中格 =25 X 16小格 =400小格,但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个，每一个大方格边长为1 mm，则每一个大方格的面积为1 mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1 mm3 。,计数时，如果使用1625的计数板，要按对角线方位取左上、左下、右上、右下上述4个中

11、格进行计数；如果使用2516规格的计数板，则除了计数上述4个中格外，还要计数中央的1个中格。分别按下述公式计算出酵母细胞数。,（1）1625格的血细胞计数板计算公式： 1 mL酵母细胞数=A/416104稀释倍数 （2）2516格的血细胞计数板计算公式： 1mL 酵母细胞数= A/525104稀释倍数,菌种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。 仪器：显微镜，血球计数板等。 其他：盖玻片，生理盐水，吸管，吕氏美蓝染液，擦镜纸，吸水纸等。,1.菌悬液的制备:稀释稀释程度以中格平均有1520个酵母为宜，可采用10倍系列稀释法。 2.镜检血细胞计数板：确证计数室上无污物或黏

12、附的微生物细胞后才可使用。 3.加菌悬液样品:盖上盖玻片吸管吹吸均匀吸取菌悬液（计数板一侧中间平台与盖玻片接触的边缘）滴一小滴菌液，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，用吸水纸吸去多余菌液。,4.显微镜计数:加样后静止5 min置于显微镜载物台上先用低倍镜找到计数室所在位置然后换成高倍镜进行计数（计数时，对位于线上酵母菌，可采取只记数两条边的办法，当酵母菌芽体达到母细胞大小的二分之一时，可记作两个细胞）。,注意事项,5.计数完毕，将计数板在水龙头下冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用电吹风吹干。,1.计数室内不可有气泡,否则将影响菌悬液随机分布而使计数产生误差。 2.为了减少误差

13、，应避免计数时的重计或遗漏。 3.直接镜检计数完毕，用蒸馏水冲洗计数板。洗后待其自行凉干，或用电吹风吹干。,直接法 涂片染色法,应用：可同时计数不同微生物的菌数，适 于土壤、牛奶中细菌计数。 方法：用镜台测微尺计算出视野面积；取 0.01ml菌液涂于1cm2面积上，计数后代 入公式： 每ml原菌液含菌数 =视野中平均菌数涂布面积/视野面积100 稀释倍数,微 生 物 学,直接法 比浊法,原理:在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。,特点：快速、简便；但易受干扰。,微

14、生 物 学,间接计数法(活菌计数)平板菌落计数法,微 生 物 学,间接计数法(活菌计数) 薄膜过滤计数法,常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。 将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。,微 生 物 学,测生长量重量法,二、测生长量,将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后烘干(干燥温度可采用105、100或80)、称重。一般干重为湿重的10%20%，而一个细菌细胞一般重约10-1210-13g。 该法适合菌浓较高的样品。 举例：大肠杆菌一个细胞一般重约10121013g，液体培养

15、物中细胞浓度达到2109个/ml时，100ml培养物可得1090mg干重的细胞。,以生物量为指标测定微生物的生长,重量法 生理指标法（碳、氮含量法，其它生理指标）,微 生 物 学,测生长量生理指标法,测含氮量 蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。 一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含量。 其他方法 含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。,微 生 物 学,6.2 微生物的生长规律,6.2

16、.1单细胞微生物的典型生长曲线,生长曲线定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线。,无分支单细胞微生物主要包括细菌和酵母菌， 其群体生长是以群体中细胞数量的增加来表示的。,以细菌为例介绍无分支单细胞微生物群体生长规律，其结论也基本适用于酵母菌。,生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、分裂直至死亡的整个动态变化过程。,微 生 物 学,将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测细菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌细胞数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。,生长曲线的制作,微 生 物 学,典型的生长曲线 （Growth curve）

17、,延滞期,指数期,稳定期,衰亡期,时期的划分：按照生长速率常数（growth race constant）不同,单位时间内分裂的次数（R）,现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。 特点： 生长速率常数R= 0; 细胞形态变大或增长; 细胞内RNA特别是rRNA含量增高，原生质嗜碱性增强; 合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），易产生诱导酶; 对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素等理化因素）. 原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物,延滞期（lag phase）,其它名称：停滞期、调整期、适应期,菌种 ： 繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短； 接种物菌龄 ： 用

18、对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期； 接种量：一般来说， 接种量增大可缩短甚至消除延迟期（发酵工业上一般采用种子:发酵培养基=1:10,v/v的接种量）； 培养基成分： 在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。,影响延迟期长短的因素：,认识延迟期的特点及形成原因对实践的指导意义：,在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期； 采取的缩短lag phase 的措施有： 增加接种量； （群体优势-适应性增强） 采用对数生长期的健壮菌种； 调整培养基的成分，在种子培养基中加入发酵培养基的某些成分。 选用繁殖快的菌种 在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌,微 生 物 学,现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。 特点： 生长速率常数最大，即代时最短； 细胞进行平衡生长，菌体大小、形态、生理特征等比较一致； 酶系活跃，代谢最旺盛. 菌种 营养成分 营养物浓度 培养温度,指数期（logarithmic phase）,影响因素：,微 生 物 学,由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的最适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄； 是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料; 发酵工业上尽量延长该期