ITS测序ppt课件

1、利用ITS序列鉴定未知真菌,温永芳 2015.6.12,1,1：ITS鉴定原理 2：PCR原理 3：电泳原理 4：具体操作,目录,2,3,一、 ITS（Internal Transcribed Spacer）鉴定是指对ITS序列进行DNA测序，通过将测序得到的ITS序列与已知真菌ITS序列比较，从而获得未知真菌种属信息的一种方法,ITS序列利用真菌rDNA上的5.8s，18s和28srDNA序列之间的转录间隔5.8s，18s和28srDNA序列进化上高度保守，而ITS序列由于选择压力小，在自然中变异较快，在绝大多数真菌中表现出序列多态性，表现为种内相对一致，种间差异比较明显，非常适合真菌鉴定以

2、及系统发育分析。,4,二、PCR原理,PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。 是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。,5,PCR的基本原理,重复13步 2530轮,目的DNA片段 扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链 与引物复性,DNA变性 形成2条单链,子链延伸 DNA加倍,6,DNA分子在高于等电点的

3、PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。,三、琼脂糖凝胶电泳原理,7,* 提取微生物样品DNA* 扩增出真菌ITS区序列* DNA测序，将样品序列与GenBank中已知序列进行比对* 判定微生物种类，可将微生物划分到属或种* 与同源性较高菌种构建系统发育树,鉴定步骤包括：,8,在PDA上培养七天的未知真菌一株,实验材料,9,离心机 水浴锅 研钵 微量移液器,仪器用具,10,电泳仪器和试剂,电泳仪、电泳槽、灌胶模具等 琼脂糖、TEV缓冲液、样品缓冲液,11,CTAB法 CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DN

4、A-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。 CTAB提取缓冲液：2%W/V CTAB;100mM Tris-Cl pH 8.0;20mM EDTA, pH 8.0; 1.4M NaCl,一、真菌基因组DNA提取,12,（1）取真菌菌丝0.2g，用液氮研磨充分，装入含有0.5mL预热的CTAB提取缓冲液的1.5mL离心管中,迅速混匀,在65水浴中保温1h,期间不定时摇匀； （2）放置室温，加入等体积酚-氯仿-异戊醇(V/V: 25241)轻柔混匀，4、7500g离心10min；抽提去蛋白 （3）取上清加入0.6倍体积异丙醇，室温下静置15min；沉淀核酸 （4）4,1000

5、0g离心15min，取沉淀，用75%乙醇洗2次，无水乙醇洗一次，真空干燥5min； （5）将沉淀溶解在200L pH8.0 TE Buffer中。 注：酚-氯仿-异戊醇于棕色瓶中4保存。,DNA提取操作步骤,13,二、PCR加样体系,14,PCR反应条件,94预变性4min； 94变性1min 50退火1min 72延伸1min 72总延伸10min； 10 保温。,32个循环,15,1.凝胶制备 制备1.0%琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖加入 20mL 0.5TBE，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至50-60 时，缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。 2.加样 取10l DNA样液与 2l 上样 bu

6、ffeer 混匀，用微量移液器小心加入样品槽。 3.电泳 接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压为15V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）,待溴酚兰移动到一定位置，停止电泳。 4.EB染色 5.观察拍照,三、琼脂糖凝胶电泳,16,17,泳道1：DL2000 泳道2：PCR产物,18,ITS测序结果,1 TCCGTAGGTG AACCTGCGGA AGGATCATTA CCGAGTGCGG GTCCTTTGGG CCCAACCTCC 61 CATCCGTGTC TATTATACCC TGTTGCTTCG GCGGGCCCGC CGCTTGTCGG CCGCCGGGGG 121 GGCGCC

7、TTTG CCCCCCGGGC CCGTGCCCGC CGGAGACCCC AACACGAACA CTGTCTGAAA 181 GCGTGCAGTC TGAGTTGATT GAATGCAATC AGTTAAAACT TTCAACAATG GATCTCTTGG 241 TTCCGGCATC GATGAAGAAC GCAGCGAAAT GCGATAACTA ATGTGAATTG CAGAATTCAG 301 TGAATCATCG AGTCTTTGAA CGCACATTGC GCCCCCTGGT ATTCCGGGGG GCATGCCTGT 361 CCGAGCGTCA TTGCTGCCCT CAAGCCCGGC TTGTGTGTTG GGTCGCCGTC CCCCTCTCCG 421 GGGGGACGGG CCCGAAAGGC AGCGGCGGCA CCGCGTCCGA TCCTCGAGCG TATGGGGCTT 481 TGTCACATGC TCTGTAGGAT TGGCCGGCGC CTGCCGACGT TTTCCAACCA T