《疫血清学技术》PPT课件.ppt

1、第十四章 免疫血清学技术,岳 华,第一节 概述,凝聚性反应 (包括凝集试验和沉淀试验) 标记抗体技术 (包括荧光抗体、酶标抗体、放射性标记抗体、发光标记抗体技术等)。 有补体参与的反应 (补体结合试验、免疫粘附血凝试验等)。 中和反应 (病毒中和试验、毒素中和试验)等。,免疫复合物散射反应 (激光散射免疫技术) 电免疫反应 (免疫传感器技术) 免疫转印(Western Blotting)等新技术。,第二节 凝聚性试验,抗原与相应抗体结合形成复合物，在有电解质存在下，复合物相互凝聚形成肉眼可见的凝聚小块或沉淀物，根据是否产生凝聚现象来判定相应抗体或抗原，称为凝聚性试验。是最简单的一类血清学试验。

2、根据参与反应的抗原性质不同，分为由颗粒性抗原参与的凝集试验和由可溶性抗原参与的沉淀试验二大类。,一、凝 集 试 验,细菌、红细胞等颗粒性抗原，或吸附在胶乳、白陶土、离子交换树脂和红细胞的抗原，与相立抗体结合，在有适当电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的凝集团块，称为凝集试验（agglutination test)。,参与凝集试验的抗体主要为IgG、lgM,又称为凝集素。凝集试验可用于检测抗原或抗体，最突出的优点是操作简便，深受基层工作欢迎。 凝集试验可根据抗原的性质、反应的方式分为直接凝集试验 (简称凝集试验)和间接凝集试验。,颗粒性抗原与凝集素直接结合并出现凝集现象的试验称作直接凝集试

3、验（direct agglutination test)。,（一）直接凝集试验,操作方法 玻片法 试管法,1、玻片法,为一种定性试验。 将含有已知抗体的诊断血清 (适当稀释)与待检菌悬液各一滴在玻片上混合，数分钟后，如出现颗粒状或絮状凝集，即为阳性反应。此法简便快速，适用于新分得细菌的鉴定或分型。如沙门氏菌的鉴定、血型的鉴定等多采用此法。 也可用已知的诊断抗原悬液，检测待检血清中是否存在相应抗体，如布氏杆菌的玻板凝集反应和鸡白痢全血平板凝集试验。,2、试管法,为一种定量试验，用已知抗原以检测待测血清中是否存在相应抗体和测定该抗体的含量，以协助临床诊断或供流行病学调查。,将待检血清用生理盐水作倍

4、比稀释，然后加入等量抗原，置37水浴数小时观察。视不同凝集程度记录为十十十十 (100%凝集)、十十十 (75%凝集)、十十 (50%凝集)、十（25%凝集)和- (不凝集)。以其“十十”以上的血清最大稀释度为该血清的凝集价 (或称滴度)。,（二）间接凝集试验,将可溶性抗原 (或抗体)先吸附于一种与免疫无关的、一定大小的不溶性颗粒 (统称为载体颗粒)的表面，然后与相应抗体 (或抗原)作用，在有电解质存在的适宜条件下，所出现的特异性凝集反应称为间接凝集反应。,间接凝集反应由于载体颗粒增大了可溶性抗原的反应面积，因此当颗粒上的抗原与微量抗体结合后，就足以出现肉眼可见的凝集反应。间接凝集反应的优点是

5、敏感性高，它一般要比直接凝集反应敏感28倍。但特异性较差。,常用的载体有红细胞 (“O”型人红细胞，羊红细胞)、聚苯乙烯胶乳颗粒，其次为白陶土、离子交换树脂、火棉胶等。 抗原多为可溶性蛋白质如细菌、立克次体及病毒的可溶性抗原、或原虫、吸虫、丝虫的浸出液、或动物的可溶性物质、或激素及各种组织器官浸出液、域植物性蛋白质如花粉浸出液等;某些细菌的可溶性多糖也可吸附于载体上。 当载体吸附了可溶性抗原后即称为致敏颗粒。,亦称被动血凝试验 (PHA)，是将可溶性抗原致敏于红细胞表面，用以检测相应抗体，在与相应抗体反应时出现肉眼可见凝集。,1、间接血凝试验 (IHAT),2、反向间接血凝试验： 如将抗体致敏

6、于红细胞表面，用以检测检样中相应抗原，致敏红细胞在与相应抗原反应时发生凝集，称为反向间接血凝试验 (reverse passive heamagglutination assay，RPHA)。,3、协同凝集试验 (co-agglutination test，COAG) 葡萄球菌A蛋白(Staphylococal Protein A,SPA)是金黄色葡萄球菌的特异性表面抗原，能与多种哺乳动物lgG分子的Fc片结合。SPA与lgG结合后，后者的Fab片暴露于外，并保持其抗体活性，当此SPA-特异性抗体与相应的抗原结合时，就可产生凝集反应。本法广泛应用于多种细菌和某些病毒的快速诊断。,（三）、间接凝

7、集抑制试验,二、沉 淀 试 验,可溶性抗原 (如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液，病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等)与相应抗体结合，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验 (precipitation test)。 参与沉淀试验的抗原称沉淀原，抗体称为沉淀素。,（一）环状沉淀试验,是最简单、最古老的一种沉淀试验，目前仍有应用。 在小口径试管内先加入已知抗血清，然后小心沿管壁加入待检抗原于血清表面，使之成为分界清晰的两层。数分钟后，两层液面交界处出现白色环状沉淀，即为阳性反应。本法主要用于抗原的定性试验，如诊断炭疽的Ascoli试验、链球菌血清型鉴定、血迹鉴定和沉淀素的效价

8、滴定等。,（二）琼脂免疫扩散试验,琼脂是一种含有硫酸基的多糖体，高温时能溶于水，冷却后凝固，形成凝胶。琼脂凝胶呈多孔结构，孔内充满水分，l%琼脂凝胶的孔径约为85nm,因此可允许各种抗原抗体在琼脂凝胶中自由扩散。抗原抗体在琼脂凝胶中扩散，当二者在比例适当处相遇，即发生沉淀反应，形成肉眼可见的沉淀带，此种反应称为琼脂免疫扩散，又简称琼脂扩散和免疫扩散。,琼脂免疫扩散试验 有多种类型，如： 单向单扩散 单向双扩散 双向单扩散 双向双扩散,1、双向双扩散 (double diffusion in two dimension) 简称双扩散。 此法系用1%琼脂浇成厚23mm的凝胶板，在其上按一定图形打圆

9、孔或长方形槽，于相邻孔 (槽)内滴加抗原和抗体，在饱和湿度下，扩散24h或数日，观察沉淀带。,抗原抗体在琼脂凝胶内相向扩散，在两孔之间比例最合适的位置上出现沉淀带，如抗原抗体的浓度基本平衡时，此沉淀带的位置主要决定于二者的扩散系数。但如抗原过多，则沉淀带向抗体孔增厚或偏移，反之亦然。,双抗散主要用于抗原的比较和鉴定，两个相邻的抗原孔 (槽)与其相对的抗体孔之间，各自形成自己的沉淀带。沉淀带的基本形式有以下三种。,二相邻孔为同一抗原时，两条沉淀带完全融合,二者在分子结构上有部分相同抗原决定簇，则两条沉淀带不完全融合并出现一个叉角。,两种完全不同的抗原，则形成两条交叉的沉淀带,不同分子的抗原抗体系

10、统可各自形成两条或更多的沉淀带,双扩散也可用于抗体的检测，测抗体时，加待检血清的相邻孔应加入标准阳性血清作为对照，以资比较。 抗体效价：测定抗体时可倍比稀释血清，以出现沉淀带的血清最大稀释度为抗体效价。,2、单向扩散 又称辐射扩散 试验在玻璃板或平皿上进行，用1.6%2.0%琼脂加一定浓度的等量抗血清浇成凝胶板，厚度为23mm，在其上打直径为2mm的小孔，孔内滴加抗原液。抗原在孔内向四周辐射扩散，与凝胶中的抗体接触形成白色沉淀环。此白色沉淀环随扩散时间而增大，直至平衡为止。沉淀环面积与抗原浓度呈正比，因此可用已知浓度的抗原制成标准曲线，即可用以测定抗原的量。,此法在兽医临床已用于传染病的诊断，

11、如鸡马立克病的诊断，可将鸡马立克高病毒免血清浇成血清琼脂平板，拔取病鸡新换的羽毛数根，将毛根剪下，插于此血清平板上，阳性者毛囊中病毒抗原向四周扩散，形成白色沉淀环。,（三）免疫电泳技术,免疫电泳技术由琼脂双扩散与琼脂电泳技术结合而成。免疫电泳技术包括： 免疫电泳、 对流免疫电泳、 火箭免疫电泳等技术。,1、免疫电泳,（1）基本原理,带电的胶体颗粒在电场的作用下，定向移动的现象称为电泳。蛋白质分子为一种两性电解质。在一定的pH下，其所带的正负电荷相等，叫做等电点。等电点时蛋白质在电场中不移动。当电泳所用缓冲液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质的氨基电离带正电荷向负极泳动，当pH大于等电点时，蛋白

12、质的羧基电离带负电荷向正极泳动。,一般电泳所用缓冲液的pH偏于蛋白质等电点的碱侧，故蛋白质带负电荷，在电场作用下向正极泳动。,（2）影响因素,泳动的速度和距离与蛋白质所带负电荷量、电场强度、介质的性质、粘度及温度，以及缓冲液的种类、pH、离子强度、电渗等因素有关。如蛋白质所带的电荷量多，电场强度大，介质的粒度小、吸附性小，缓冲液的离子强度较低，pH偏离蛋白质等电点较远，琼脂的电渗作用较小，则泳动速度快，反之则慢。,（3）电渗流,由于电泳时所用支持物，一些极性集团也带有负电荷，但固相部分不能移动，而与琼脂相接触的液体相则带正电荷，可向负极移动，造成电渗流。此时蛋白质分子电泳的表面速度，实际上是其

13、本身向正极移动的电泳速度与电渗作用之差值。,（4）流程,一混合物中各组分在电泳后，便可依其电泳力与电渗力的不同，而形成不同的区带，使各组分分布于支持物的不同位置上。,再加入相应抗血清免疫扩散,在最适比例处形成数条沉淀弧线。每一条沉淀弧线，即代表一对抗原、抗体反应。并由于抗原 (混合物中各组分)向四周扩散，而抗体则为垂直扩散;故沉淀弧线呈弯曲弧型。,2、对流免疫电泳,在加有抗原、抗体的琼脂凝胶中，通电电泳时，出现抗原、抗体向相反方向泳动的现象，称为对流免疫电泳。,（1）基本原理,抗原、抗体由于等电点不同，在pH偏碱性的环境中，所带负电荷也有差异。抗原所带负电荷多，在电泳时向正极泳动，而抗体则接近

14、其等电点，所带负电荷少，又加琼脂的电渗作用，故电泳时，抗体向负极移动。如二者相对应时，即可在相遇的最适比例处形成一条白色沉淀线。,（2）流程,制板 打孔 加样（于负极端孔中加入抗原，正极端孔中加入抗血清 ） 电泳（1小时）,（3）火箭电泳,在电场作用下，抗原在含定量抗体的离子琼脂中泳动后，如二者比例合适时，可在短时间内出现锥形的沉淀峰，形似火箭状，故又称为火箭电泳。此沉淀峰的高度与抗原的浓度成正比，与抗体的浓度成反比。单向琼脂免疫电泳技术常用于检测标本中的免疫球蛋白含量。,烟草花叶病毒火箭电泳图,第三节 补体参与的试验,第四节 中和试验,根据抗体能否中和病毒的感染性而建立的免疫学试验称为中和试

15、验。中和试验极为特异和敏感，主要用于病毒感染的血清学诊断、病毒分离株的鉴定、不同病毒株的抗原关系研究、疫苗免疫原性的评价、免疫血清的质量评价和测定动物血清抗体的检测等。,抗血清+病毒（毒素） 接种宿主 （共同孵育 ） 动物 禽胚 细胞 中和指数 保护效果,根据测定方法的不同，中和试验主要分两种。 1、终点法中和试验：测定能使动物或细胞死亡数目减少至50%(半数保护率，PD50)血清稀释度。 2、空斑减少法中和试验：测定使病毒在细胞上形成的空斑数目减少至50%时血清稀释度。,毒素和抗毒素亦可进行中和试验，其方法与病毒中和试验基本相同。 一、终点法中和试验 本法是滴定使病毒感染力减少至50%的血清

16、中和效价或中和指数。有固定病毒稀释血清及固定血清稀释病毒两种滴定方法。,将已知的病毒量固定，血清作倍比稀释，常用于测定抗血清的中和效价。,（一）固定病毒稀释血清法,病毒的毒价滴定 1、最小致死量 (MLD)：毒力或毒价单位过去多用最小致死量 (MLD)，即病毒接种实验动物后在一定时间内全部致死的最小病毒剂量。此法比较简单，但由于剂量递增与死亡率递增的关系不是一条直线，而是呈S形曲线，在愈接近100%死亡时，对剂量的递增愈不敏感。,2、半数致死量（ LD50 ）：当死亡率愈接近50%时，剂量与死亡率呈直线关系，故现基本上采用半数致死量 (LD50)表示毒价单位。 而且LD50的计算应用了统计学方

17、法，减少了个体差异的影响，因此比较正确。,3、半数感染量 (ID50)：以感染发病作为指标的，可用半数感染量 (ID50); 4、半数反应量 (RD50)：以体温反应作指标者，可用半数反应量 (RD50)。 5、鸡胚半数致死量(ELD50) ： 6、鸡胚半数感染量 (EID50); 7、组织培养半数感染量 (TCID50)：,空斑减数试验系应用空斑技术，以使空斑数减少50%的血清量作为中和滴度。,8、空斑减数试验 (Plague reduction test),正常细胞,CPE,接种病毒8小时后的细胞,接种病毒24小时后的细胞,试验时，将已知空斑单位 (PFU)的病毒稀释成每一接种剂量含100PFU，加等量递进稀释