基因诊断与基因治疗.ppt

1、1,第二十一章 基因诊断与基因治疗,2,第一节 基因诊断,一、基因诊断的含义 基因诊断（gene diagnosis） 亦称分子诊断、DNA诊断。采用分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因的结构（DNA水平）或功能（RNA水平）是否异常，以此来对相应的疾病进行诊断。,3,二、基因诊断的原理及方法,1 基因诊断的原理 检测相关基因的结构及其表达功能特别是RNA产物是否正常 2 基因诊断的方法 （1）DNA诊断 （2）RNA诊断,4,（1）DNA诊断 1）限制性片段长度多态性 2）等位基因特异的寡核苷酸探针杂交 （allele-specific oligonucleotide probe,

2、 ASO probe） 3）单链构象多态性（SSCP） 4）DNA序列分析 （2）RNA诊断 1）RNA印迹（Northern blot） 2) RT-PCR,5,1）限制性片段长度多态性 基因连锁分析,（1）方法原理： 待测DNA序列中的点突变导致了某一限制性内切酶识别位点的改变可引起其特异的限制性内切酶片段的大小与多少随之改变，即而通过Southern印迹杂交和限制性内切酶酶谱分析诊断出点突变。,6,6,（2）诊断原理在人群中，个体间DNA的核苷酸序列存在差异，称为DNA多态性。DNA多态性可以改变限制性内切酶的切割位点，产生DNA限制性片段长度多态性（restriction fragme

3、nt lenth polymorphism, RFLP）。,7,7,RFLP按照孟德尔方式遗传，在某一特定家族中，如果某一种致病基因与特异的多态性片段紧密连锁，就可利用这一多态性片段作为一种遗传性标志来判断家族成员或胎儿的基因组中是否携带致病基因。,8,8,9,9,（2）应用 A sickle-cell anemia 的基因诊断 a. 病因 血红蛋白中的珠蛋白N端第6位氨基酸正常为谷氨酸，贫血时突变为颉氨酸。,10,10,1,2,3,4,5,6,11,11,b. 检测 限制性内切酶： Sau1 酶切位点： CCTNAGG 探针： 标记的珠蛋白,12,12,c. 结果分析 切割正常待测血红蛋白珠

4、蛋白，DNA与探针杂交后产生1.1kb 切割异常待测血红蛋白珠蛋白，DNA与探针杂交后产生1.3kb,13,13,14,14,15,15,（1）原理根据已知的基因突变位点的核苷酸序列，人工合成相应于突变基因异 常核苷酸序列的寡核苷酸作为杂交探针，从而直接检测和鉴定突变基因。,2）等位基因特异性寡核苷酸探针杂交法 （allele specific oligonucleotide, ASO）,16,16,相应于突变基因异常 相应于正常基因 核苷酸序列的寡核苷 核苷酸序列的寡核苷 杂交探针 酸杂交探针,与受检者DNA 进行分子杂交,发生杂交 均可杂交 与异常 不发生杂交 (突变纯和子 ） （杂和子）

5、 与正常发生杂交(正常纯和子 ）,17,17,18,18,1）病因 H-ras （化学诱导） ras家族 K-ras 编码P21蛋白 N-ras （自然发生) ras家族点突变好发于 12、13、61位密码子,（2）应用 大肠癌K-ras 的基因诊断,19,19,2）检测a、PCR扩增 用人工合成的位于待测点突变两侧的引物，分别扩增含12、13、及61位点的基因片段。,20,20,b、ASO分析 将扩增产物结合在尼龙膜上分别与ras原癌基因密码子12、13、61所有可能引起碱基突变的寡核苷酸探针进行杂交； 杂交后，膜经严格的洗涤，仅允许完全相配的杂交双链存在； 针结合处在光胶片上呈阳性斑点,2

6、1,22,22,3）mRNA的检测（1）原理 通过对mRNA进行定量、检测其 剪接加工的缺陷以及外显子变异等判断基因能否转录、转录物（mRNA）是否正常以及转录效率的高低。,23,23,*mRNA不稳定可将其转为cDNA再用PCR技术进行研究（RT-PCR）,24,24,（2）应用,视网膜母细胞瘤：Rb基因缺陷 Rb1基因的mRNA全长4.7kb采用RT-PCR技术分析外显子突变或mRNA前体剪接异常。,25,25,分析外显子19至22间的基因突变逆转录引物：外显子22反义链序列 5-GGTACCGTGGAAGCTTACTGCAAAT-3PCR引物: 外显子22正义链序列5-CCATGGGAC

7、CTTCGAATGACGTTTA-3 外显子19正义链序列5-GAATTCGTATCTTTCTCCTGTAAGAT-3,26,26,用RT-PCR检测艾滋病,27,三、基因诊断的应用,1. 遗传疾病的诊断 产前诊断、遗传病易感性 2 感染性疾病 （1）病毒性感染 （2）细菌性感染 （3）寄生虫 （4）其他,28,3 恶性肿瘤 4 法医学中应用,29,（1）DNA指纹分析（DNA fingerprinting） 可变串联重复序列 小卫星DNA （variable number of tandem repeat, VNTR）,30,（2）短串联重复（short tandem repeat, STR

8、）多态性分析 微卫星DNA STRPCR,31,第二节 基因治疗的基本概念和 基本策略 一 基因治疗（gene therapy）的概念 1、背景与历史 疾病的分子生物学了解 新技术新方法（特别是重组DNA）的迅速发展,32,1989年5月28日第一个基因标记计划 （TIL-NeoR） 1990年9月 11日第一个基因治疗计划 （ADA-SCID）,33,1995年NIH组织 Orkin 、Motoksy对 头5年基因治疗评估 3点 建议： 发展载体技术 疾病的分子机制 动物模型 成立3个国家实验室 2000年2月 532个计划，3400余个病人,34,病种：恶性肿瘤 62.2% 遗传性疾病 1

9、3.3% AIDS 6.8% 心血管疾病 6.8% 其他 1.3 %,35,2、定义 基因角度： 正常或有功能的基因置 换或增补缺陷基因。 治疗角度： 新的遗传物转移到某个 体获治疗效果。,36,3、方式 基因矫正和置换: 同源重组 基因增补: ADA、 血友病 基因封闭: myc基因过度表 达，反义抑制 活化前体药物基因治疗：,37,单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因 导入 肿瘤细胞 合成 HSV-TK 无毒性的抗病毒 有毒性的抗病毒 药物（GCV） 药物（GCV 三磷酸） 细胞死亡,38,4、导入方式 ex vivo 基因转移 in vivo 基因转移,39,第三节 基因治疗的条件 1、目的基因

10、的种类： 细胞因子、缺陷基因、抑癌基因、 受体基因,40,1、 目的基因的获得方法 1） 真核基因组DNA文库中 目的基因的克隆 2） cDNA文库中目的基因的 克隆 3） 人工合成基因片段 4） PCR法筛选扩增目的基因,41,1、 外源基因的要求 1） 含信号肽的cDNA，序列 正确 2） 必要的调控元件（顺式 作用元件 启动子、增强 子、静止子）,42,3） 外源基因进入细胞核转录， 再转移至细胞浆，间隔序 列（内含子），剪接信号 （SA,SD）PolyA信号，核 内转录因子4） 翻译的起始密码子、终止 密码子、内核糖体进入位 点（IRES）元件5） 外源基因的丢失、失活、甲基 化,43

11、,4、基因治疗的靶细胞（target cell） 1） 生殖细胞 全世界受严格控制 2） 体细胞 选择的标准： A、 容易取出和移植 B、 容易体外培养 C、 目的基因高效导入 D、细胞寿命长,44,常用靶细胞； 自体、 同种异体、 异种、 淋巴、骨髓、皮肤、肝、肌、 肿瘤细胞等,45,46,基因导入的方式： ex vivo体外将基因导入target cell ,然后将此修饰过 的细胞回输给病人。 In vivo外源基因直接导入体 内有关的组织器官。,47,3、 基因导入（转移）的工具与方法。 将外源基因或DNA片断导入宿主细胞进行扩增或表达，需要有一个能在该宿主细胞进行复制和表达的载体（ve

12、ctor）来携带。前者与后者在体外构成重组DNA分子，然后导入宿主细胞。,48,1）非病毒方法,49,50,（一）磷酸钙转染技术 磷酸钙-DNA 导入细胞 吞噬体 转运 细胞器 瞬时 稳定 外源基因存在 外源基因非特异 于染色体DNA外 与宿主染色体DNA重组 12小时内表达 持续约3-4天 降解 稳定转化细胞株,51,（二） DEAE-葡聚糖转染技术（略）,52,（三）脂质体转染法 （20%） 聚阳离子脂质体-DNA 脂质体DNA阳离子复合物 负电荷的细胞膜吸收此复合物 （融合吸收） 优点：简便、低毒性、无免疫原性、 无病毒产生、化学成分已知可 大量商业供应 缺点：转染效率低，短暂表达,53

13、,（四）电穿孔转染技术 靶细胞（悬浮态）+外源目的DNA电穿孔仪 高压电脉冲 靶细胞膜发生瞬时可逆性破裂 形成微孔 外源目的DNA进入靶细胞,54,（五）基因枪技术 电子发射装置或高压气流 金或钨颗粒包裹外源目的DNA形成“子弹” 打入靶细胞,55,上述物理、化学方法转移基因 的缺点：1） 转移效率低，多应用于实 验研究2） 维持时间短2、 病毒方法,56,在以基因治疗为目的的载体系统中，以病毒载体最为常用，其优点： 1） 易于改造与操作 2） 转移效率高 3）较高的靶细胞特异性,57,病毒载体： 逆转录病毒(retrovirus)载体用于具有分裂功能的 细胞中进行基因转移 与表达,58,腺病

14、毒 (adenovirus)、腺相关病毒(adeno-associated- virus 用于非增殖性细胞中进行基因转移与表达,59,（六）逆转录病毒载体 1、逆转录病毒的结构 由2条相同的38S单链 RNA组成 2、逆转录病毒的生活周期,60,61,62,感染宿主细胞 病毒基因组的整和 原病毒DNA的转录与翻译 逆转录病毒颗粒的释放,63,3、原病毒DNA的结构特点,64,65,4、逆转录病毒载体的构建,66,67,5、包装细胞系的构建1）没有包装细胞，逆转录病毒载体就不能装配成假 病毒颗粒感染靶细胞， 完成外源基因的高效转移,68,2） 去除莫洛尼氏小鼠5端含有包装信号一段序列 辅助病毒

15、整和 NIH3T3染色体 形成 包装细胞系 转录编码病毒结构基因 携带外源基因的逆 不能包装成病毒颗粒 转录病毒载体（含有包装信号）导入该细胞系 提供 病毒结构基因 提供 包装信号 包装成仅含有外源目的基因假病毒,69,6、逆转录病毒-包装细胞系的 特点1） 感染增殖分裂的细胞2） 转移效率高3） 有效整和、传代4） 宿主范围广（七）腺病毒载体 1、腺病毒载体的结构,70,71,72,3、腺病毒载体的特点 1） 可感染非增殖分裂的细胞 2） 易于培养与储存 3） 非整和 4） 可致免疫反应（八）质粒 DNA直接注射,73,基因治疗的基本过程,74,靶基因+载体重组DNA分子靶细胞病人,75,举

16、例： 细胞因子修饰肿瘤细胞降 低其致瘤性提高其免疫原性,76,1、 靶基因 ：细胞因子（ - TNF,IL-2,- IFN,等） 2 载 体 ： 逆转录病毒 LTR gag pol env LTR,77,逆转录病毒载体PLN系列： LTR NEO LTR,78,3、 包装细胞：PA317 ,包装 为病毒 4 、感染靶细胞 5、 在靶细胞中表达基因产物,79,基因治疗的安全性问题: 2次事故 靶向性、效、基因整合位 点、表达调控,80,基因敲除（knock out）与基因添加 （knock in） 遗传工程生物中，一个正常基因可被几种 方式所改变 方法1： 正常基因完全被基因的突变拷贝所替换 可以在没有正常基因的 干扰下提供突变 基因活