色谱分离技术.ppt

1、1,色谱分离技术,2,1903年，俄国植物学家Tsweet将CaCO3固体粉末装入竖立的玻璃管中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸出液，并用石油醚连续地冲洗。结果在柱中出现了颜色不同的色带。因此，Tsweet把这种方法称为色谱法。,3, 1903年 Tswett创立色谱法（在碳酸钙上分离了叶绿素）。 由Tswett创立的色谱法分离效率低，分离时间长，根据样品的不同，一般分离需要几小时至几天。,20世纪40年代至50年代初，先后出现了纸色谱（paper chromatography, PC）和薄膜色谱法(thin-layer chromatography,TLC)。 特点：较经典色谱法简单、分离时间

2、短，样品量要求小。,1952年，James和Martin提出了气相色谱法（gas chromatography,GC)特点： 以气体作为流动相。应用范围广泛受到人们重视。但对不易气化和热不稳定性差的化合物难以分离。, 20世纪60年代后期由于新型色谱柱填料，高压输液泵和高灵敏度的监测器的出现，发展出了高效液相色谱（High performance liquid chromatograghy,HPLC）。,4,如今，色谱法不仅用于有色物质的分离，而且大量用于无色物质的分离。所以色谱法已经失去原来的含义。但是，现在仍沿用色谱法这个名称。 色谱法具有分离及分析两种功能。它是分析混合物最有力的手段。

3、色谱分离是目前应用最广泛的分离方法。已广泛地用于石油化工、有机合成、生理生化、医药卫生、环境监测、刑事侦查、生产在线控制，乃至空间探索等许多领域，以解决各种分离分析课题。,5,什么是色谱法？,色谱法是一种分离、分析方法，有时又称为层析技术。它利用被分离的诸物质在互不相溶的两相中分配系数等的微小差异进行分离。当两相作相对移动时，使被测物质在两相之间进行反复多次分配，使原来微小的差异累加产生了很大的效果，形成差速迁移，使各组分在柱内移动的同时逐渐分离，以达到分离、分析及测定一些物理化学常数的目的。,6,两种组分的理化性质原本存在着微小的差异，经过反复多次地吸附解吸再吸附再解吸的过程使微小差异累积起

4、来，结果使吸附能力弱的组分先流出色谱柱，吸附能力强的组分后流出色谱柱，从而使各个组分得到了分离。,吸附解吸再吸附再解吸,色谱过程,7,对复杂混合物各组分进行 定量和定性分析,8,1色谱法的特点： 与经典的分离提纯手段（重结晶，升华，萃取和蒸馏等）相比，色谱法具有快速，简便和高效率等优点。并能对复杂化合物，甚至立体异构体进行分离。 液相色谱（含柱，薄层色谱）适合于固体物质和具有高蒸汽压的油状物的分离，不适合低沸点液体的分离。 气相色谱适合于容易挥发物质的分离。,9,2色谱法的优点 （1）分离效率高。 （2）应用范围广。 （3）分析速度快。 （4）样品用量少。 （5）灵敏度高。 （6）分离和测定一

5、次完成。可以和多种波谱分析仪器联用 （7）易于自动化，可在工业流程中使用。,10,色谱分类,1. 流动相与固定相 聚集态,11,色谱法分类,2.根据操作压力的不同分类 低压色谱 0.5MPa 中压色谱 0.55MPa 高压色谱 5 50MPa,12,3.按操作形式： 柱色谱 分离体系采用圆柱管 纸上色谱固定相是滤纸或将固定相载于纸上 薄层色谱固定相是一层吸附剂物料，平铺于惰性平板上 凝胶色谱,色谱法分类,13,4.按分离原理分类： 吸附色谱法：利用吸附剂（固定相一般是固体）表面对不同组分吸附能力的差别进行分离。 分配色谱法：利用不同组分在两相间的分配系数的差别进行分离。 离子交换色谱：利用溶液

6、中不同离子与离子交换剂间的交换能力的不同而进行分离。 凝胶色谱法：利用多孔性物质对不同大小的分子的排阻作用进行分离。,14,5.按应用目的分类： 制备性色谱：目的是分离混合物，获得一定数量的纯净组分。 分析性色谱：目的是定量或者定性测定混合物中各组分的性质和含量。定性的分析性色谱有薄层色谱、纸色谱等，定量的分析性色谱有气相色谱、高效液相色谱等。,生产型制备液相色谱系统,高效液相色谱仪,15,色谱分离的基本原理,利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、 吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。,16,色谱相关术语,试样经色谱柱获得分离，按先后次序经过检测器时，检测器就将流动相中各组分浓度变化转变成

7、电信号，由记录仪记录下信号时间曲线，称为色谱流出曲线或色谱图。,17,由色谱图可直接得到的相关术语： 基线 色谱峰 色谱时间 由色谱图可间接得到的相关术语： 色谱体积 相对保留值,18,基线(Baseline),在色谱操作条件下，仅有流动相通过检测器时，由记录仪得到的信号时间曲线。,基线漂移：基线随时间定向缓慢的变化。 基线噪声：由于各种原因引起的基线波动。不论有无组分流出，其噪声均 存在，它是一种背景信号。,19,色谱峰(Chromatographic peak),流动相带着组分通过检测器时，由记录仪得到的信号时间曲线。,峰底(Peak base)：从峰的起点到峰的终点之间连线。 峰高(Pe

8、ak hight)：峰的顶点至峰底的垂直距离,通常用h表示。 峰面积（Peak area）：峰与峰底之间的面积，用A表示。,20,色谱峰区域宽度(Peak width),是色谱流出曲线的一个重要参数，它直接反映了分离条件的好坏。习惯上有下面三种表示方法： 1）标准偏差：峰高0.607处色谱峰宽度的一半,用表示。 2）峰宽或基线宽度：通过峰两侧的拐点作切线与峰底相交的宽度，用Y表示。与标准偏差的关系为：Y=4。 3）半峰宽：峰高一半处色谱峰的宽度,用Y1/2表示。与标准偏差的关系为：Y1/2=2(2ln2)1/2。,21,色谱时间,色谱时间主要有： 死时间（Dead time）：不被固定相吸附或

9、溶解的惰性组分，从进样到出峰的峰顶点之间测得的时间,用tM表示。 保留时间（Retention time）：从进样到组分峰顶点之间测得的时间，用tR表示。 调整保留时间(Adjusted Retention Time)：调整保留时间指组分的保留时间扣除死时间后的时间，用tR表示。tR=tR-tM,22,色谱体积,色谱体积主要有： 死体积（Dead Volume）：死体积指色谱柱填充固定相后的空隙体积，又指在死时间内流动相流经色谱柱的体积。死体积通常用Vm表示。 Vm= tMFC Fc表示流动相的体积流速（mL/min） 保留体积（Retention Volume）：保留体积指从进样开始，到检测

10、器中样品浓度最大时，流动相流经色谱柱的体积。通常用VR表示。 VR= tR FC 调整保留体积(Adjusted Retention Volume)：调整保留体积指保留体积扣除死体积后的体积。通常用VR 表示。 VR=tR FC,23,相对保留值（Relative Retention Value）,相对保留值指某组分i与基准组分s的调整保留值之比。通常用ris表示。,24,色谱流出曲线的意义： 色谱峰数：样品中单组份的最少个数； 色谱保留值定性依据； 色谱峰高或面积定量依据； 色谱保留值或区域宽度色谱柱分离 效能评价指标； 色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的依据。,25,色谱理论,研究色谱

11、过程中分子运动的规律，探讨微观分子运动与色谱分离的内在联系。 热力学 动力学 分离条件的选择和优化,26,塔板理论,它把色谱柱看成一个分馏塔分馏塔是分离沸点不同的混合物的一种装置，一般有十几层塔片。在塔的底层加热，利用各组分的挥发性不同，在塔片上经过多次气液平衡，最终低沸点组分在塔顶的流出液中含量高，而高沸点组分在塔底层含量高。 塔板理论，是人为的认为在色谱柱中存在着塔片。在每个塔片高度的间隔内，样品混合物的各组分，在流动相与固定相达到分配平衡。而后各组分被流动相携带转移至另一层塔片，再达分配平衡。,27,经多次转移平衡，各组分按分配系数大小的顺序，依次流出色谱柱（分配系数小的先出柱）。由于一

12、根色谱柱的塔片数比精馏塔多得多（103104片），因此，只要分配系数间存在微小的差别，则可获得很好的分离。,28,塔板理论是由Martin等人在平衡色谱理论的基础上发展起来的。他们假定： 1流动相按前进方向以脉冲式通过柱子，最小单位为一塔板体积; 2. 组分在柱内两相间的分配系数是恒定的，与组分浓度及在柱内的位置无关; 3. 组分在所有塔板上的两相平衡在瞬间建立; 4. 流动相不能被压缩； 5. 所有组分浓度以起始塔板中的浓度为基准,29,由塔板理论可得到：在色谱过程中色谱峰是要展宽的，展宽的宽度平方值和理论板高H成正比。即相达成“平衡”所需的距离H值越大，则色谱峰展宽也就越严重。反之，若理论

13、板高H值越小。而就一定柱长而言，组分在两相间的“平衡”次数就越多，色谱柱的分离效率就越高，因此理论板高H值是衡量色谱柱效率的一个很好的指标。 塔板理论回答了影响色谱峰保留时间和峰宽度这二个重要问题，但它没有回答宽度也就是相应的理论板高究竟受哪些操作条件的影响。,30,理论塔板数越大，峰形越窄，柱效越高。,塔板高度表示单位柱长下的柱效。 塔板高度越小，表明柱效越高，理论塔板数越多。,31,1952年Lapidus等对填充柱色谱过程做了较详细的研究，指出色谱过程中引起组分宽度扩张的因素主要是： 1.沿柱流动方向的纵向扩散效应； 2.组分在两相间的平衡不能瞬时达成，即它在两相交换时传质速度是有限的。

14、,非平衡速率理论,32,这就是著名的范底姆特方程。也可把Van Deemter方程描述为：,33,与气相色谱不同，液相色谱有其特点，因而其速率理论的表述方式也有区别：,各项分别为：涡流扩散项、分子扩散项、传质阻力项（固定相、流动流动相和滞留流动相）,34,传质速率控制理论,根据溶质从液相主体到吸附剂上吸附点的过程建立模型。 液膜传质扩散速率控制模型 吸附剂表面吸附速率控制模型 孔扩散速率控制模型,35,气相色谱,气相色谱法主要利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异，以气体为流动相，以液体或固体为固定相从而达到分离混合物的色谱方法。,36,气相色谱法的特点,优点： 分离效率高、应用范围宽、分析速度

15、快、样品用量少; 灵敏度高、分离和测定一次完成、自动化程度高. 缺点： 不适用于高沸点（450）、有生物活性的物质的分离测定 不适用于制备.,37,38,待测样品在高温的气化室气化后在惰性气体的带动下进入色谱柱，色谱柱内含有液体或固体固定相 每种组分都倾向于在流动相和固定相之间形成分配或吸附平衡。但由于载气是流动的，这种平衡实际上很难建立。 由于载气的流动，使样品组分在运动中进行反复多次的分配或吸附、解吸。 结果是在载气中分配浓度大的组分先流出色谱柱，而在固定相中分配浓度大的组分后流出色谱柱，进入检测器。,39,甲醇和乙醇混合样色谱图,40,高效液相色谱,高效液相色谱法（HPLC）是20世纪6

16、0年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。 它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。,41,高效色谱仪,42,43,首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。 当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。,44,蔬菜、水果中农药残留 的检测,45,苯和丙酮混合样的色谱

17、图,46,液相色谱的主要特点是： 分离效率高； 选择性好，适用于多种多元组分复杂混合物的分离； 应用范围广。从无机物到有机物，从天然物质到合成产物，从小分子到大分子，从一般化合物到生物活性物质等。,47,凝胶色谱,是以各种具有网状结构的凝胶颗粒为固定相，根据流动相中所含各种组分的分子大小不同而达到物质分离目的的一种色谱技术。 凝胶渗透色谱 凝胶过滤色谱,48,基本原理,大分子物质在凝胶颗粒间隙中运动 小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落

18、后于大分子物质 结果使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。,49,优点：操作方便、不会使物质变性、适用于不稳定的化合物、凝胶不用再生、可反复使用。 缺点：分离速度较慢。,50,分离过程,51,凝胶柱床总体积是各部分体积之和。 溶质分子在流动相和固定相之间的分配系数与被分离物质分子大小及凝胶颗粒内孔隙大小有关。Kd 值在01之间。 可通过实验求出Kd ，进而判断溶质的行为模式。,52,凝胶色谱介质,理想的凝胶过滤介质具有高物理强度及化学稳定性，能够耐受高温高压和强酸强碱，具有高化学惰性，内孔径分布范围窄，珠粒颗粒大小均一度高。 凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。 目前，常用的有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。,53,凝胶色谱的应用,脱盐 去除小分子物质 相对分子质量测定 一定范围内，蛋白质的分配系数与相对分子质量的对数呈线性关系。 分离纯化 浓缩,54,离子交换色谱,是通过带电的溶质分子与离子交换介质中可交换的离子进行交换而达到分离纯化目的的方法。 该方法分辨率高、容量大、容易操作。,55,基本原理,带电物质因电荷力作用而在固定相与流动相之间分配得以相互分离。 蛋白质是两性电解质。当 pH pI时，蛋白质带净负电荷。 由于各种蛋白质等生物大分子的等电点不同，可以通