9.基因工程抗体和抗体工程.ppt

1、第五节 抗体工程,抗体研究进展3个阶段： 1890年白喉抗毒素，多克隆抗体； 1975年杂交瘤技术单克隆抗体； 1994年基因工程抗体；,C genes code for the constant regions of immunoglobulin protein chains.V gene is sequence coding for the major part of the variable (N-terminal) region of an immunoglobulin chain.,Immunoglobulin genes are assembled from their parts

2、 in lymphocytes,Figure 24.4 Heavy and light chains combine to generate an immunoglobulin with several discrete domains.,Immunoglobulin genes are assembled from their parts in lymphocytes,Figure 24.4 Heavy and light chains combine to generate an immunoglobulin with several discrete domains.,Immunoglo

3、bulin genes are assembled from their parts in lymphocytes,Table 24.1 Each immunoglobulin family consists of a cluster of V genes linked to its C gene(s).,Immunoglobulin genes are assembled from their parts in lymphocytes,Figure 24.5 The lambda C gene segment is preceded by a J segment, so that V-J r

4、ecombination generates a functional lambda light-chain gene.,Immunoglobulin genes are assembled from their parts in lymphocytes,Figure 24.6 The kappa C gene segment is preceded by multiple J segments in the germ line. V-J joining may recognize any one of the J segments, which is then spliced to the

5、C gene segment during RNA processing.,Immunoglobulin genes are assembled from their parts in lymphocytes,Figure 24.7 Heavy genes are assembled by sequential joining reactions. First a D segment is joined to a J segment; then a V gene segment is joined to the D segment.,Immunoglobulin genes are assem

6、bled from their parts in lymphocytes,Figure 24.8 The lambda family consists of V gene segments linked to a small number of J-C gene segments.,The diversity of germline information,Figure 24.9 The human and mouse kappa families consist of V gene segments linked to 5 J segments connected to a single C

7、 gene segment.,The diversity of germline information,Figure 24.10 A single gene cluster in man contains all the information for heavy-chain gene assembly.,The diversity of germline information,Figure 24.12 Consensus sequences are present in inverted orientation at each pair of recombining sites. One

8、 member of each pair has a spacing of 12 bp between its components; the other has 23 bp spacing.,Recombination between V and C gene segments generates deletions and rearrangements,Figure 24.13 Breakage and reunion at consensus sequences generates immunoglobulin genes.,Recombination between V and C g

9、ene segments generates deletions and rearrangements,Figure 15.8 Reciprocal recombination between direct repeats excises the material between them; each product of recombination has one copy of the direct repeat.,Recombination between V and C gene segments generates deletions and rearrangements,Figur

10、e 15.9 Reciprocal recombination between inverted repeats inverts the region between them.,一、噬菌体抗体库技术的基本方法,获取目的基因 抗体库技术的载体 淘筛 表达与鉴定,它是在PCR技术和Phage Display的基础上实现的。其过程是把用PCR法得到的抗体基因插入丝状噬菌体的DNA，与噬菌体外壳蛋白的基因相连，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状噬菌体，抗体分子通过与P 或P相连，在噬菌体表面的一端或分散分布，然后可直接对噬菌体表面的抗体分子进行筛选。,噬菌体抗体库技术,1990年Mc Caffe

11、rty等成功地建立了噬菌体表面展示系统，通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于fd噬菌体基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，利用亲和层析，两轮富集达106倍。该技术的成功给抗体基因的筛选工作带来了革命性的变革。,噬菌体表面展示系统(phage surface display system ),噬菌体表面展示文库技术的要点:,外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端,将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因 g3或g8 的先导系列的紧靠下游,随机克隆入相应载体形成组合文库,从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段,用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环

12、直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。,使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。,筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌，,该项技术的优点: 将抗体的基因型和表型紧密联系起来; 可绕过杂交瘤技术，不需要复杂的基因工程技术; 抗体基因筛选的范围广; 技术稳定、可靠、生产周期短;可规模化生产; 适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其它蛋白如激素、酶、药物、随机多肽等的生产。,噬菌体抗体库技术的发展具有很大优越性。它简单易行，筛选容量大，效率高，绕过了细胞融合及免疫等步骤，而且在表型一基因型的统一和识别一增殖过程

13、上模拟了B细胞的成熟过程，从而在实际应用上具有很大意义。,二、噬菌体抗体库技术的特点,模拟天然全套抗体库 避开了人工免疫和杂交瘤技术 可获得高亲和力的人源化抗体,单克隆抗体 噬菌体抗体 杂交瘤技术 展示技术,宿主细胞: 杂交瘤 细菌 筛选范围 : 103 107109 时间: 几个月 几周 操作: 繁杂 相对简单 免疫: 必须 可避免 人源抗体: + 费用: 高 低 生产量: 有限 无限 基因获取: 再克隆 直接 应用前景: 有限 不可估,三、基因工程抗体表达,原核细胞表达 真核细胞表达 转基因植物表达 转基因动物表达,第六节 抗体诊断试剂,一、血清学鉴定用的抗体类试剂 鉴定病原菌的抗体试剂

14、常用诊断血清的品种和用途 沙门氏菌属诊断血清 志贺氏菌属诊断血清 病原性大肠埃希氏菌诊断血清,诊断血清的制备步骤 制备细菌抗原 免疫动物和制备抗体血清 诊断血清诊断方法,乙型肝炎病毒表面抗原的 反向被动血凝诊断试剂 妊娠诊断试剂 抗ABO血型系统血清,二、免疫标记技术用的抗体类试剂,荧光抗体诊断试剂 荧光抗体的制备 免疫荧光测定方法 免疫酶抗体诊断试剂 免疫酶染色法用抗体诊断试剂 酶免疫测定用抗体诊断试剂 HBsAg酶标诊断试剂 HBeAg酶标诊断试剂,HAVAg（甲型肝炎病毒抗原） 酶标诊断试剂 测定HIV（人免疫缺陷病毒）抗 原的酶标抗体诊断试剂 甲胎蛋白（AFP）酶标抗体诊 断试剂 癌胚

15、抗原（CEA）的酶标抗体 诊断试剂,放射免疫用抗体诊断试剂 放射免疫技术是将放射性核素分析的高度灵敏性与抗原抗体反应的特异性结合起来建立的检测技术。 放射性核素标记抗体的方法： 氯胺-T法 Iodogen氏法,抗原的测定有： 夹心法 间接法 竟争法,3.竞争法 Ag AgAb + Ab Ag(标本) (定量) AgAb,E,E,终止液,标本,酶标抗体,底物,显色,显色,固相,固相,标本,酶标二抗,底物,1.夹心法,2.间接法,HBsAg放射性核素标记抗体 诊断试剂 HBeAg放射性核素标记抗体 诊断试剂 HAV抗原放射性核素标记抗体 诊断试剂 AFP放射性核素标记抗体 诊断试剂 CEA放射性核

16、素标记抗体 诊断试剂,常用标记抗体试剂有：,三、导向诊断药物,放射性核素标记抗体 肿瘤放射免疫显像 放射免疫显像优点： 在体内确切肿瘤定位作用，准确性达90%，灵敏度达100%。 在体内可检出0.5cm大小的病灶，并可检出肺脑的转移灶。,小分子抗体易到达肿瘤部位， 可显著提高N/NT值。 抗体在肿瘤部位可保留69日 能观擦抗体在血中的半衰期和 可能出现的不良反应。,放射免疫显像定位技术 将抗肿瘤单克隆抗体（Ab）与二乙基三胺五乙酸（DTPA）在体外偶联成Ab-DTPA，再注入体内后，就能与体内组织相结合。由于抗体分子量大，需3天完成。3天后注入放射性核素In-113M（半衰期100m），因DT

17、PA是重金属离子络合剂，所以In-113M可以结合到DTPA分子上，使肿瘤组织显像。这一过程在2小时内可完成。,建立预定位技术需解决3个问题： 抗体在肿瘤组织滞留要7天以上。 Ab-DTPA偶联物比较稳定； 内源性金属离子对DTPA的封闭 作用要小。,第六节 抗体治疗药物,以抗体为载体的导向治疗药物，还不成熟。 一、放射性核素标记的抗体治疗药物 抗体作为放射性核素的导向载体，标记操作简便用量小。放射性核素标记的抗体对肿瘤细胞杀伤较大。,二、抗癌药物偶联的抗体药物 常用的抗癌药物 氨甲喋呤（MTX）、阿霉素（ADM）、丝裂霉素（MMC）等。以人血浆白蛋白作为中间载体，可明显提高每分子抗体所携带的

18、MTX量，使体外细胞毒性体高二倍。,抗体类药物逆转耐药性 肿瘤细胞对抗原药物可产生多药耐药性（MDR）。 MDR是由基因调控的，其编码蛋白称为P糖蛋白，其中P170是与肿瘤耐药相关的主要蛋白，由Mdr1基因编码，1280氨基酸残基，分子量170K。,认为P蛋白是ATP酶依赖性药泵，药物进入细胞后与P蛋白结合，利用ATP水解释放的能量将药物泵出胞外，使胞内药物蓄积减少，因而产生耐药性。,三、毒素偶联的抗体药物 免疫毒素及其换代制品 在导向药物中，毒素和抗体的交联物称为免疫毒素。 第一代免疫毒素是包含有A、B链完整毒素和抗体的交联物，其中B链非特异性结合，使其仅在体外应用。,第二代免疫毒素是利用抗体或抗体片段与毒素的A链或与A链相似的单链核糖体失活蛋白的结合物。因避免了第一代免疫毒素的非特异性，故能在