仪器分析-高效液相色谱法课件

1、1,第三章 高效液相色谱法(HPLC),High Performance Liquid Chromatography,2,3,4,5,高效液相色谱法是继气相色谱之后，70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术.,3- 1 高效液相色谱法概述,6,7,高效液相色谱,8,三 、液相色谱分离原理及分类,液相色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。,根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化学键合相色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。,9,四、液相色谱与气相色谱的比较,10,2、

2、不同点,11,气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。使其应用受到一定程度的限制，据统计只有大约20%的有机物能用气相色谱分析；,而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70 80%。,12,（3）液相色谱分离能力比气相色谱更强,因为：气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用（只能选择固定相）。,而在液相色谱中，流动相液体也与固定相

3、争夺样品组分分子，为提高选择性增加了一个因素。还可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性（能同时选择固定相和流动相） 。,13,液相色谱固定相类型多,如离子交换色谱和排阻色 谱等，作为分析时选择余地大；而气相色谱是不 可能的。 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般 有利于色谱分离条件的选择。,（4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容 易，而且回收是定量的，可以做成制备色谱。,（5）液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复 杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱 技术是互相补充的。,14,综上所述，高效液相色谱法具有高柱效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好

4、、应用范围广等优点。该法已成为现代分析技术的重要手段之一，目前在化学、化工、医药、生化、环保、农业等科学领域获得广泛的应用。,15,3- 2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 （液相色谱速率理论）,与气相色谱速率理论对照自学。,16,1.,3- 3、4、5 高效液相色谱的主要类型及分离原理,1、吸附色谱（液-固吸附色谱）：以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。,2、分配色谱（液-液分配色谱）：早期通过在载体上涂渍一薄层固定液制备固定相, 现多为化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在载体表面。,17,3

5、.离子交换色谱：固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。,4.离子对色谱法：将一种（或数种）与溶质离子电荷相反的离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对，从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法。,18,5.离子色谱法：用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相，以电导检测器检测组分含量，用抑制柱消除强电解质背景离子对电导检测器的干扰。（与离子交换色谱法不同的是分离组分的检测器不同）,6.凝胶色谱（空间排阻色谱）：以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的通

6、称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。,19,二、液一液分配色谱法（LLPC）,在液-液色谱中，流动相和固定相都是液体，它能适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的、水溶性和油溶性的、离子型的和非离子型的化合物。,1分离原理 液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。,20,(1)担体(表面多孔型) 它是3040m的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 2m

7、的多孔硅胶。由于固定相仅是表面很薄一层，因此，传质速度快，加之是直径很小的均匀球体，装填容易，重现性好，现已广泛使用！ 但表面积小，柱容量低，需用高灵敏度检测器。,2、固定相,21,由于液液色谱中流动相参与选择竞争，因此，对固定液选择较简单，只需使用几种极性不同的固定液即可解决分离问题。,（2）固定液,A 强极性固定液，一氧二丙腈 B 中等极性的聚乙二醇 C 非极性的角鲨烷等。,22,为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了化学键合固定相。 它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法，它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可以认为它的出现是液

8、相色谱法的一个革命性突破。 是目前应用最广泛的一种固定相。据统计，约有3/4以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的。,（4）化学键合固定相（CBPC）,23,A 原理：利用化学反应，使硅胶表面的硅羟基与 各种固定液有机物或有机硅化合物反有 应，将固定相与载体之间形成化学键， 采用化学键合相的液相色谱称化学键合 相色 谱法。,由于键合固定相非常稳定，在使用中不易流失，适用于梯度淋洗，特别适用于分离容量因子k值范围宽的样品。由于键合到载体表面的官能团可以是各种极性的，因此它适用于种类繁多样品的分离。,24,B 化学键合类型,25,26,此法的固定相是采用极性较小的键合固定相，如硅胶C18H37（

9、ODS，C18）、硅胶苯基等；流动相是采用极性较强的溶剂，如甲醇水、乙腈一水、水和无机盐的缓冲溶液等，由于流动相极性大于固定相极性，称反相健合相色谱法。,27,A 它多用于分离多环芳烃等低极性化合物； B 采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液为流动相，也可用于分离极性化合物； C 若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等。 反相键合相色谱法具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点。,28,这种色谱方法主要用于分离异构体、极性不同的化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。,（3）离子型键合相色谱法,以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合各种离子交换基团，

10、如SO3H、CH2NH2、COOH等时，就形成了离子性键合相色谱的固定相；流动相一般采用缓冲溶液。其分离原理与离子交换色谱类同。,29,3、流动相,在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越显著越好。根据所使用的流动相和固定相的极性程度。,正相分配色谱: 适用于极性化合物的分离，其流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。 反相分配色谱： 适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反。,30,三、液一固吸附色谱法(LSAC),液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面

11、存在吸附中心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。,1、分离原理 当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，与流动相溶剂分子（S）在固定相表面发生竞争吸附: X + n S吸附= X吸附 + nS,31,其中K为吸附平衡常数，K值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。K值小,则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此得以分离。K值可通过吸附等温线数据求出。,达平衡时，有：,32,2、固定相,吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不同的吸附剂，如硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。等。由于硅胶的优点较多，因此，

12、以硅胶用得最多。,33,一般把液-固吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。,3、流动相,34,四、离子交换色谱法（IEC）,利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广。,1、离子交换原理,离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相离子交换剂交换能力的差别来实现分离的。,35,固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的

13、带电荷基团和可游离的平衡离子。待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换。,2、离子交换固定相,36,阳离子交换：,阴离子交换：,一般形式：,离子交换反应：,37,固定相基质大致有三大类：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶。 离子交换剂又有阳离子和阴离子之分。再根据官能基的离解度大小还有强弱之分（见下表）,38,3、离子交换色谱流动相,离子交换色谱法所用流动相大都是一定pH和盐浓度（或离子强度）水的缓冲溶液。 通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和pH值可控制k值，改变选择性。,分离有机酸和有机碱时，这些酸碱的离解程度可通过改变流动相的pH值来控制。增大pH值会使酸的电离度

14、增加，使碱的电离度减少；降低pH值，其结果相反。但无论属于哪种情况，只要电离度增大，就会使样品的保留增大。,39,五、离子色谱法（IC）,离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。 1、离子交换色谱法对无机离子分离检测的困难 在普通离子交换法中，对于那些不能采用紫外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景电导信号掩没而无法检测，因而，离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。,40,为了解决这一问题，1975年Small等人提出一种能同时测定多种无机和有机离子的新技术。他们在离子交换分离柱后加一根抑制柱，抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子

15、交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相。,2、离子色谱法原理 以离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相，利用抑制柱消除流动相强电解质对测量影响，以电导检测器检测组分信号的色谱分析方法。,41,例如对于阴离子分析，色谱柱内为阴离子交换树脂，在流动相中，待测阴离子（如Br-）与阴离子交换树脂上的OH-离子交换：,交换,42,在阴离子分析中，最常见的洗脱液是NaOH ，洗脱过程中，OH-离子从分离柱的阴离子交换位置置换出待测阴离子Br-。当待测阴离子从柱中被洗脱下来进入检测器电导池时，要求能检测出洗脱液中电导的改变。但洗脱液中OH-离子的浓度要比

16、试样中阴离子浓度大得多才能使色谱柱正常工作。因此，与洗脱液的电导值相比，由于试样离子进入洗脱液而引起的电导的改变非常小，因而，用电导检测器直接检测试样中离子的灵敏度极差。,43,若在色谱柱中，设立一个抑制柱，抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相。 上例分析中，若使分离后的洗脱液通过填充有高容量H+型阳离子交换树脂的抑制柱，则在抑制柱将发生如下反应：,44,可见，从抑制柱中流出的洗脱液中，洗脱液（NaOH）已经变成电导很小的水，消除了本底的影响；试样阴离子则转变为相应的酸，由于H+的离子趟度很大，所以，大大提

17、高了电导检测的灵敏度。,3、离子色谱法装置,45,46,4、离子色谱法优点,双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3250 mm), 流动相：0.003molL-1 NaHCO3 / 0.0024 molL-1 Na2CO3，流量138 mL/h。 七种阴离子在20 min内基本上得到完全分离，各组分含量在350 ppm。,47,48,离子对分配机理： 离子对色谱的分离机理主要是离子对分配机理; 假如有一离子对色谱体系，固定相为非极性键合相，流动相为水溶液; 在流动相中加入一种电荷与待分离组分离子X+带相反的对离子Y-，则组分离子X+与对离子Y-首先形成离子对化合物X+ Y-，然后在固定相和流动相

18、中分配：,49,由于离子对化合物X+ Y-具有疏水性，因而被非极性固定相提取。组分离子的性质不同，它与反离子形成离子对的能力大小不同以及形成的离子对疏水性质不同，导致各组分离子在固定相中滞留时间不同，因而出峰先后不同。这就是离子对色谱法分离的基本原理。,50,平衡常数：,51,正相离子对色谱法：极性疏水性固定相，非极性流动相；,反相离子对色谱法：这种色谱法的固定相采用非极性的疏水性化学键合固定相如十八烷基键合相（ODS）等，流动相为加有平衡离子（反离子）的极性溶液（如甲醇一水或乙睛一水）。,键合相反相离子对色谱法操作简便，只要改变流动相的pH值、平衡离子的浓度和种类，就可在较大范围内改变分离的选择性，能较好解决难分离混合物的分离问题。此法发展迅速，应用较广泛。,52,七、凝胶色谱法（SEC）,1、定义： 基于试样中组分分子的尺寸和形状不同来实现分离的色谱分析方法，称凝胶色谱法，又名尺寸排阻色谱法，主要用于较大分子的分离。,53,凝胶: 指含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类：,（1）软性凝胶 具有较小的交联结构，其微孔能吸入大量的溶剂，并能溶胀到它们干体的许多倍。它们适用以水溶性溶剂作流动相，一般用于小分子质量物质的分