基因工程基本操作定.ppt

1、1.2基因工程的基本操作程序,一、目的基因的获取,（一）从基因文库中获取目的基因,1. 基因组文库,受体菌包含了某种生物所有的基因，该受体菌群体称为这种生物的基因组文库。,2. 部分基因文库,受体菌包含了一种生物部分基因，该受体菌群体称为这种生物的部分基因文库，如cDNA文库。,指满足人们需要，能编码蛋白质的结构基因。,3. 基因文库的构建,（1）基因组文库的构建,提取某生物 全部DNA,用适当 限制酶切割,许 多 DNA片段,与载体连接 导入受体菌群,该生物基 因组文库,（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）,（2）cDNA文库的构建mRNA反转录形成,mRNA,逆转录酶,杂交双链,核酸酶H

2、,单链DNA,DNA聚合酶,双链DNA,与载体连接 导入受体菌群,该生物 cDNA文库,PCR技术聚合酶链式反应,原理： 前提： 条件：,PCR扩增仪,DNA双链复制的基本原理,一段已知目的基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,热稳定DNA聚合酶(Taq酶）,DNA的两条链为模板,温度控制,（二）利用PCR技术扩增目的基因,PCR技术扩增过程,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下， 断裂，形成_,b、复性（55-60）：系统温度降低，引物 与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从 引物的5端3端延伸，合成与模板互补 的_。,氢键,

3、单链DNA,双链,DNA链,双链DNA是在高温条件下解链为单链DNA的，因此整个过程不需要解旋酶。,（三）通过DNA合成仪直接合成目的基因,蛋白质的氨基酸顺序,mRAN 核苷酸序列,基因DNA的核苷酸序列,目的 基因,推测,推测,合成,当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。,目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,二、基因表达载体的构建,1.下表关于基因工程中有关基因操作 的名词及对应的内容，正确的组合是,3. PCR技术扩增DNA,需要的条件是( ) 目的基因引物四种脱氧核苷酸DNA聚合酶等mRNA

4、核糖体 A、B、 C、 D、,2、下列属于获取目的基因的方法的是( ) 利用mRNA反转录形成 从基因组文库中提取 从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成 A. B. C. D.,4.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B有利于对目的基因是否导入进行检测 C增加质粒分子的分子量 D便于与外源基因连接 5.哪项不是基因表达载体的组成部分( ) A.启动子 B.终止密码 C.标记基因 D.目的基因,目的基因插入Ti质粒的T-DNA上 农杆菌 导入植物细胞 整合到受体细胞的染色体上 目的基因的遗传特性得以维

5、持稳定和表达,1.农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物。Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞的染色体上,2.转化,（一）导入植物细胞,（2）基因枪法 （3）花粉管通道法,三、将目的基因导入受体细胞,导入受体细胞的方法 主要 是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径，且因受体细胞的不同而不同。,显微注射技术,含目的基因的表达载体,动 物 的 受 精 卵,含目的基因的受精卵,早 期 胚 胎,雌性动物输卵管或子宫,转基因 动 物,显微 注射,分裂 分化,移 植,发 育,问题,为什么将目的基因导入动物细胞常用的受体细胞是受精卵？,（二）导入动物细胞,（三）导入微生物细胞,2. 优点 繁殖快、多为单细胞、遗传物

6、质相对较少、操作简单、价格低廉。,3. 常用受体细胞 大肠杆菌（E.coli）,1. 过程,（1）制备感受态细胞：用Ca2+（CaCl2）处理细菌，使细菌细胞壁通透性增加，易于接受外源DNA分子。,（2）重组DNA分子与感受态细胞混合孵育，完成转化。,Ca2+ 处理法,四、目的基因的检测与鉴定,目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。,常用的检测手段主要从分子水平和个体水平进行。,（一）分子水平,1. 检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因,提取受体生 物全部DNA,适当限制 酶切割,DNA片段,用同位素标记的 目的

7、基因片段杂交,显 出 杂交带,（表明目的基因已插入）,分子杂交技术,2. 检测目的基因是否转录出了mRNA,提取受体生 物的mRNA,用同位素标记的 目的基因片段杂交,显 出 杂交带,（表明目的基因已转录出了mRNA）,检测DNA利用的是DNA与DNA杂交，检测mRNA利用的是DNA与mRNA杂交。,3. 检测目的基因是否翻译出蛋白质,抗原抗体杂交技术,提取受体生 物的蛋白质,与相应抗体杂交,显 出 杂交带,（表明目的基因已形成蛋白质产品）,（二）个体水平,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,

8、归纳: 基因工程的基本操作程序,获取目的基因 从基因文库 利用PCR扩增 化学方法人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、显微注射法、Ca 2+处理 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译,1.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法( ) A基因枪法 B显微注射法 C.农杆菌转化法 D花粉管通道法,2.早期的基因工程的受体细胞主要是（ ） A动物细胞 B植物细胞 C.病毒 D原核生物,3.要检测目的基因是否成功的插入了受体DNA中，需要用基因探针，基因探针是指 A用于检测疾病的医疗器械 B用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子 C合成一球蛋白的DNA D合成苯丙羟化酶的DNA片段,4.科学家将动物控制合成胰岛素的基因与大肠杆菌的DNA分子拼接在一起并在大肠杆菌内成功表达，如下图 指出图中2、4、6、7的名称