蛋白质性质试验.ppt

1、实验 蛋白质的部分性质,一、试验原理 蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦不完全相同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质也可产生同样的颜色反应，因此不能根据颜色反应的结果来决定被测物是否为蛋白质。另外，颜色反应也可作为一些常用蛋白质定量测定的依据。,第一部分、蛋白质的颜色反应,二、实验仪器 1、吸管 2、滴管 3、试管 4、电炉 5、pH试纸 6、水浴锅 三、实验试剂 1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。 2、 0.5%苯酚：1g苯酚加蒸馏水稀释至200ml。 3、

2、Millons试剂：40g汞溶于60ml浓硝酸（水浴加温助溶）溶解后，冷却，加二倍体积的蒸馏水，混匀，取上清夜备用。此试剂可长期保存。 4、尿素晶体 5、1%CuSO4：1g CuSO4晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml 6、10%NaOH：10g NaOH溶于蒸馏水，稀释至100ml 7、浓硝酸 8、0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%的乙醇并稀释至100ml. 9、 冰醋酸 10、浓硫酸,四、实验步骤 （一） 米伦（Millons）反应 原理：米伦试剂是硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物。他能与苯酚及某些二羟基苯衍生物起颜色反应。组成蛋白质的氨基酸中只有酪氨酸含苯酚基团，因此该反

3、应为蛋白质中酪氨酸存在的依据。 操作： 1、苯酚实验： 取0.5%苯酚溶液1ml于试管中，加Millons试剂0.5ml，于电炉上小心加热，溶液即出现玫瑰红色。 2、蛋白质实验： 取2ml蛋白液，加Millons试剂0.5ml，出现白色的蛋白质沉淀，小心加热，凝固的蛋白质出现红色。,（二） 双缩脲反应 原理：尿素被加热，则两分子的尿素放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成紫色的化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故也能进行此反应。双缩脲反应可作为蛋白质定量测定的依据。 操作： 1、取少量尿素晶体放在干燥的试管中，微火加热使其熔化成液体， 此

4、时有氨气放出，可用湿润的试纸检验，至液体重新结晶出现白色固体时， 停止加热，冷却。然后加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。 2、取蛋白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。,（三） 黄色反应 原理：蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），于浓硝酸可反应并生成黄色物质，此物质在碱性环境下变为桔黄色的硝基苯衍生物硝醌酸等。 操作：取一支试管，加入1ml蛋白液及浓硝酸5滴。加热，冷却后注意颜色变化。然后再加入10%NaOH溶液1ml，颜色有什么变化？,（四） 茚三酮

5、反应 原理：蛋白质与茚三酮共热，产生兰紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及a-氨基酸所共有。亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应呈黄色，含有氨基的其他物质亦呈此反应。 操作：取蛋白液1ml于试管中，加4-8滴茚三酮溶液，加热至沸，即有蓝紫色出现。,第二部分、蛋白质的沉淀反应,一、试验原理 蛋白质是亲水性胶体，在溶液中的稳定性与质点大小、电荷、水化作用有关，但其稳定性是有条件的，相对的。如果条件发生了变化，破坏了蛋白质的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。,蛋白质胶体溶液的稳定因素：水化膜、带电荷。当破坏这两个因素时，蛋白质中从溶液中析出而产生沉淀。,二、实验仪器 1、

6、移液管 2、吸管 3、试管 4、电炉 三、实验试剂 1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。 2、饱和硫酸铵溶液：100ml蒸馏水中加硫酸铵至饱和。 3、硫酸铵晶体：用研钵研成碎末。 4、95%乙醇。 5、醋酸铅溶液：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml 6、硫酸铜溶液：1g CuSO4晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml 7、氯化钠晶体 8、10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于蒸馏水中并稀释至100ml 9、饱和苦味酸溶液：100ml蒸馏水中加苦味酸至饱和。 10、1%醋酸溶液。,四、实验步骤 （一）蛋白质的盐析作用 原理：向蛋白质中加入大量

7、的中性盐（硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等），使蛋白质胶体颗粒脱水，破坏其水化层，同时它所带有的电荷亦被中性盐上所带的相反电荷的离子所中和。于是稳定因素被破坏，蛋白质聚集沉淀。盐析作用一般不使蛋白质变性。 操作：1、取试管1支，加蛋白液2ml，然后加固体硫酸铵(加的过程要缓慢，加的量要少随时摇匀），直至其饱和（大约为50%）。摇匀静置数分钟，则有球蛋白析出。 2、将上述混合液过滤。向滤液中逐渐加入少量固体硫酸铵（每次加入量约为米粒大小），边加边摇，直至饱和为止，此时析出为清蛋白。再加入少量蒸馏水，观察沉淀是否溶解。,（二）有机溶剂沉淀蛋白质 原理：某些有机溶剂（如乙醇、甲醇、丙醇等），因引起蛋白质脱去

8、水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚而沉淀。 操作：取一试管加蛋白液1ml，加入晶体氯化钠少许，待溶解后再加95%乙醇3ml,摇匀，观察现象。,（三）重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质 原理：重金属离子（如Pb2+、Cu2+等）与蛋白质的羧基等结合生成不溶性的金属盐类而沉淀，同时蛋白质发生变性。某些有机酸的酸根则与蛋白质的自由氨基结合而沉淀。 操作：1、取试管2支，各加蛋白液2ml，一支管中滴加1%醋酸铅溶液，另一支管中滴加1%硫酸铜溶液，至有沉淀产生。,（四）生物碱试剂沉淀蛋白质 原理：植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物成为生物碱。能沉淀生物碱或与其产生

9、颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸等。当溶液PH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与生物碱试剂的负离子发生反应而沉淀。 操作：取2支试管，分别加入蛋白液2ml及醋酸4-5滴，再加饱和苦味酸和鞣酸数滴，观察现象。,（一） 米伦（Millons）反应 1、苯酚实验：取0.5%苯酚溶液1ml于试管中，加Millons试剂0.5ml，电炉小心加热观察颜色变化。 2、蛋白质实验：取2ml蛋白液，加Millons试剂0.5ml，出现白色的蛋白质沉淀，小心加热，观察现象。 （二） 双缩脲反应 1、取少量尿素晶体放在干燥的试管中，微火加热熔化，至重新结晶时冷却。然后加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加

10、2-4滴1% CuSO4溶液，混匀，观察现象。 2、取蛋白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混匀，观察现象。 （三） 黄色反应 取一支试管，加入1ml蛋白液及浓硝酸5滴。加热，冷却后注意颜色变化。然后再加入10%NaOH溶液1ml，颜色有什么变化？ （四） 茚三酮反应 取蛋白液1ml于试管中，加10滴茚三酮溶液，加热至沸，即有蓝紫色出现。,（一）蛋白质的盐析作用 1、取试管1支，加蛋白液2ml，然后加固体硫酸铵(加的过程要缓慢，加的量要少，随时摇匀），直至其饱和（大约为50%）。摇匀静置数分钟，则有球蛋白析出。 2、将上述混合液过滤。向滤液中逐渐加入

11、少量固体硫酸铵，直至饱和为止，此时析出为清蛋白。再加入少量蒸馏水，观察沉淀是否溶解。 （二）有机溶剂沉淀蛋白质 试管中加蛋白液1ml，加晶体氯化钠少许，溶解后加95%乙醇3ml,摇匀，观察现象。 （三）重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质 1、取试管2支，各加蛋白液2ml，一支管中滴加1%醋酸铅溶液，另一支管中滴加1%硫酸铜溶液，至有沉淀产生。 2、取一支试管加蛋白液2ml，再加入10%三氯乙酸1ml，充分混匀，观察结果。 （四）生物碱试剂沉淀蛋白质 取一支试管，加入蛋白液2ml及醋酸4-5滴，再加饱和苦味酸数滴，观察现象。,蛋白质的颜色反应,蛋白质的沉淀,通过生物化学实验应该做到：, 学习设计一个

12、实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。 训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学实验仪器。 学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验，培养严谨细致的科学作风。 掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，为今后参加科研工作打下坚实的基础。,实验室规则, 实验前必须认真预习实验内容，明确本次实验的目的和要求，掌握实验原理。 实验时自觉遵守实验室纪律，保持室内安静，不大声说笑和喧哗。 实验过程中要听从教师指导，认真按照实验步骤和操作规程进行实验。若想改进和设计新的实验方法，必须取得教师的同

13、意。实验时认真进行实验记录，实验完毕及时整理数据，按时上交实验报告。, 实验台面、称量台、药品架、水池以及各种实验仪器内外都必须保持清洁整齐，药品称完后立即盖好瓶盖放回药品架，严禁瓶盖及药勺混杂，切勿使药品（尤其是NaOH）洒落在天平和实验台面上，毛刷用后必须立即挂好，各种器皿不得丢弃在水池内。 配制试剂按实验实际使用量配制，多余的重要试剂和各种有机试剂要按教师要求进行回收；昂贵试剂需要回收，不得丢弃。, 配制的试剂和实验过程中的样品，尤其是保存在冰箱和冷室中的样品，必须贴上标签、写上品名、浓度、姓名和日期等，放在冰箱中的易挥发溶液和酸性溶液，必须严密封口。 强酸强碱以及其他实验废液必须倒入废液桶。电泳后的凝胶和各种废物不得倒入水池，只能倒入废物桶。 使用贵重精密仪器应严格遵守操作规程。使用分光光度计时不得将溶液洒在仪器内外和地面上。仪器发生故障应立即报告教师，未经许可不得自己随意检修。 实验室内严禁吸烟、饮水和进食， 严禁用嘴吸移液管和虹吸管。易燃液体不得接近明火和电炉，凡产生烟雾、有害气体和不良气味的实验，均应在通风条件下进行。, 实验完毕必须及时洗净并放好各种玻璃仪器，插好自动部分收集器上的试管，保持实验台面和实验柜内的整洁。 严禁抄拿他组仪器，不得将器皿遗弃在分光光度计内和其他实验台面上，打破了玻璃仪器要及时向教师报告，