色谱分析法概论1.ppt

1、张静 食品与生物工程学院,色谱分析法概论,色谱分析法,hellenzhangj163.cm QQ:123136848,高效液相色谱仪,气相色谱仪,质谱仪,Contents,色谱分析法概述,色谱法的发展趋势及应用,基本类型色谱法的分离机制,色谱过程和相关术语,1.1 色谱分析法概述,色谱法又称色层法或层析法，是一种物理化学分析方法，它利用不同溶质（样品）与固定相和流动相之间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次“平衡”，使各溶质达到相互分离。,1.1.1 概念,色谱法是以其高超的分离能力为特点，它的分离效率远远高于其它分离技术如蒸馏、萃取、离心等方法

2、。,1.1 色谱分析法概述,1.1 色谱分析法概述,俄国植物学家 茨维特,俄国植物学家 M.Tswett 是色谱法创始人。1901-1906年，用色谱法分离、提纯植物色素。,1931年，Kuhn 等用同样的方法成功地分离了胡萝卜素和叶黄素，从此色谱法开始为人们所重视，相继出现了各种色谱方法。,1941，马丁(Martin)和辛格(Synge)创始分配色谱,1952年，马丁与辛格，以气体作为流动相，创立了气相色谱法。,1970年以后逐渐发展了高效液相色谱法以及各种模式、多种高性能的检测器和连用手段。,1.1.2 历史,Tswett植物色素分离实验图示： 样 品：植物色素 固定相：CaCO3颗粒

3、流动相：石油醚,1.1 色谱分析法概述,1.1 色谱分析法概述,1.1.2 历史,1.1 色谱分析法概述,1.1.3 色谱分析法分类,色谱法的分类,按流动相状态,气相色谱法：流动相为气体,液相色谱法：流动相为液体,超临界流体色谱法：采用近乎临界状态的稠密气体为流动相。这种状态下，流动相对多种物质具有良好的溶解性，因此许多在气相色谱过程中不稳定的化合物，在液相色谱上难以分离的化合物可以采用超临界。,按固定相状态,气固色谱法：固定相为固体吸附剂，流动相为气体,气液色谱法：固定相是液体，流动相是气体,液固色谱法：固定相是固体，流动相是液体,液液色谱法：固定相与流动相均是液体,1.1 色谱分析法概述,

4、1.1.3 色谱分析法分类,1.1.3 色谱分析法分类,利用组分在流动相和固定相之间的分离原理不同,吸附色谱法,利用吸附剂对样品的吸附性能不同达到分离,分配色谱法,样品组分在固定相和流动相之间的溶解度存在差异，因而实现在两相间进行分配,利用被分离物质在离子交换树脂上的离子交换势不同而使组分分离,利用被分离物质分子量大小的不同和在填料上渗透程度的不同，以使组分分离,1.1 色谱分析法概述,根据固定相在色谱分离系统中使用的方式分为三类,柱色谱,纸色谱,薄层色谱,将固定相放在玻璃、不锈钢、石英等管中，该管称为色谱柱，该色谱方法称为柱色谱,固定相是用一张纸，并在上面涂以固定液。一般就是在纸上吸上水，成

5、为纸上固定液，再用另一种溶剂作冲洗剂,将固定相均匀地涂在玻璃或其他材料的平板上，形成一个固定相的薄层，用来进行色谱分离,1.1 色谱分析法概述,1.1.3 色谱分析法分类,为提高组分的分离效能和高选择性，采取多种技术措施，根据色谱技术的性质不同而形成了多种色谱分类,程序升温气相色谱法,反应气相色谱法,裂解气相色谱法,顶空气相色谱法,毛细管气相色谱法,多维气相色谱法,制备色谱法,1.1.3 色谱分析法分类,1.1 色谱分析法概述,冲洗法,顶替法,迎头法,冲洗法:色谱分析中主要用的是冲洗法，其它两种方法用得很少。冲洗法就是把样品加在固定相上，然后用流动相冲洗。根据吸附能力和分配系数的不同，按次序洗

6、脱出来。分配系数最小的先出来。冲洗剂，或者是气体，或者是液体不断加上去。,根据流动相洗脱的动力学过程不同进行分类,1.1 色谱分析法概述,1.1.3 色谱分析法分类,1.1.4 色谱法的特点,分辨效率高,应用范围广,分析速度快,样品用量少,灵敏度高,1.1 色谱分析法概述,1.1.4 色谱法的局限性,色谱法本身不能够直接给出定性结果，需要用已知标准物质或将数据与标准数据对比，或与其他方法，如质谱、红外光谱等连用才能获得较可靠结果,定量测定时需要用标准物质对检测器信号进行修正,对某些异构体、某些固定物质的分析能力较差,1.1 色谱分析法概述,1.2 色谱过程和相关术语,1.2.1 色谱过程 色谱

7、过程是物质分子在相对运动的两相间分配平衡的过程。在混合物中，若两个组分的分配系数不等，则被流动相携带移动的速率不等，即形成差速迁移而被分离。如图所示：,1.2 色谱过程和相关术语,色谱过程的实质,(1)色谱过程是吸附与解析的过程；,(2)不同组分极性的差异导致吸附与解析的差异；,(3)不同组分向前移动的过程是差异不断累积过程，是在动态中由量变到质变的过程。,1.2.1 色谱过程,1.2 色谱过程和相关术语,1.2.2 基本术语,1.色谱 2.保留值 3.分配系数(K)和容量因子(k) 4.分离参数,1.2 色谱过程和相关术语,1.2.2 基本术语1.色谱,检测色谱分离后组分的响应信号对时间作图

8、得到的曲线称为色谱图。,名词术语：色谱峰、基线、峰高h、标准偏差、峰宽W、半高峰宽Wh/2、峰面积A；,色谱峰：有组分流出时，出现的峰状微分流出曲线。 基线：当没有组分进入检测器时，色谱流出曲线是一条只反映仪器噪声随时间变化的曲线。 峰高：色谱峰最高点至峰底的垂直距离。 峰宽：沿色谱峰两侧拐点处所做的切线与峰底相交两点之间的距离。,1.2.2 基本术语1.色谱,1.2 色谱过程和相关术语,半高峰宽：在峰高为0.5h处的峰宽GH，常用符号Wh/2表示。 峰面积：组分的流出曲线与基线所包围的面积（即峰与峰底之间的面积） 标准偏差：在峰高0.607h处峰宽EF的一半，成为标准偏差，常用符号表示，W=

9、4。,1.2.2 基本术语1.色谱,1.2 色谱过程和相关术语,1.2.2 基本术语2.保留值,1.2 色谱过程和相关术语,名词术语： 保留时间tR 死时间tM 调整保留时间tR 保留体积VR 死体积VM 调整保留体积VR,保留时间：组分从进样到出现峰最大值所需的时间，常用符号tR表示。 死时间：不被固定相滞留的物质（如空气等）的保留时间，常用符号tM表示。 调整保留时间：组分保留时间减去死时间后的值，常用符号tR表示。,1.2 色谱过程和相关术语,1.2.2 基本术语2.保留值,1.2 色谱过程和相关术语,1.2.2 基本术语2.保留值,保留体积：组分从进样到出现峰最大值所需的载气体积，常用

10、符号VR表示。 死体积：不被固定相滞留的物质的保留体积，常用符号VM表示。 调整保留体积：组分保留体积减去死体积后的值，常用符号VR表示。,1.2 色谱过程和相关术语,1.2.2 基本术语3.分配系数K和容量因子k, 分配系数(K)：色谱过程中，在流动相和固定相中的溶质分子处于动态平衡。平衡时组分在固定相(s)与流动相(m)中的浓度(c)之比，称为分配系数(K) ，也称为分配平衡常数,分配系数的差异是所有色谱分离的实质性的原因,在吸附色谱中称为吸附系数(Ka)；,在离子交换色谱中称为选择性系数(Ks)；,在凝胶色谱中称为渗透系数(Kp),1.2 色谱过程和相关术语,1.2.2 基本术语3.分配

11、系数K和容量因子k, 容量因子(k) ：在平衡状态下，组分在固定相(s)与流动相(m)中的质量之比，称为容量因子。色谱柱的容量因子是溶质分子与色谱柱填料相互作用强度的直接量度，由下式定义：,1.2 色谱过程和相关术语,1.2.2 基本术语4.分离参数, 分离度 (Rs)：相邻两个组分的色谱峰，其保留时间差与两峰峰底宽平均值之商。, 分离因子()：即相邻两个组分调整保留值之比，又称为分配系数比或选择性系数比。,1.2 色谱过程和相关术语,1.2.2 基本术语4.分离参数,色谱分析的目的就是要将混合物中的各组分分离，为获得较好的准确度，一般规定两相邻峰的分离度 Rs1.5时，可认为两组分完全分离,

12、1.3.1 吸附色谱法（Liquid-Solid Chromatography，LSC ） 1.3.2 分配色谱法（Partition Chromatography，PC ） 1.3.3 离子交换色谱法（Ion-Exchange Chromatography，IEC） 1.3.4 空间排阻色谱法（Size Exclusion Chromatography，SEC ）,1.3 基本类型色谱法的分离机制,1.3 基本类型色谱法的分离机制,1.3.1 吸附色谱法,吸附色谱法:利用同一吸附剂对混合物中不同成分吸附能力的差异，而使各成分达到分离目的,是最早期的一种色谱分离技术，主要应用于某些分子量不大的

13、物质的分离提纯,吸附是表面的一个重要性质之一。任何两相都可以形成表面，其中某相或溶解在某相中的溶质，在该表面的密集现象称为吸附。 利用固体吸附剂作为固定相，常用的固定相是硅胶、氧化铝和活性炭等,表面积越大的吸附剂，吸附能力越强。,各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心，吸附剂一般与待分离化合物的极性官能团相互作用,原理（分离机制）,吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来，然后再吸附、再解吸，形成一个动态平衡。吸附色谱过程就是不断地产生吸附与解吸的矛盾统一的过程,1.3.1 吸附色谱法,1.3 基本类型色谱法的分离机制,一般采用含水量10-20%的硅胶（硅胶的吸附活性取决于含水量，

14、当含水量小于1%时活性最高，大于20%时吸附活性最低）。用硅胶进行色谱分离时，要提前进行活化和纯化。纯化即降低硅胶活性，实验表明，硅胶加入4-20%水后，表面活性部位被纯化，样品溶质在吸附剂上的吸附和解吸过程加快，同时传质作用得到改善，最终柱效大幅提高。,1.3 基本类型色谱法的分离机制,1.3.1 吸附色谱法,吸附剂的选择，活性大or活性小,1.3 基本类型色谱法的分离机制,1.3.2 分配色谱法,将液体均匀地涂渍在惰性物质（载体）表面上作为固定相，利用被分离组分在固定相与流动相中的溶解度差别所造成的分配系数差别而被分离,分配色谱示意图 Xm流动相中游离的组分分子 Xs固定相中溶解的组分分子

15、,原理（分离机制）,1.3 基本类型色谱法的分离机制,1.3.2 分配色谱法,要 求,固定相：机械吸附在惰性载体上的液体,载体：惰性，性质稳定，不与固定相和流动相发生化学反应；纯净，颗粒大小均匀,流动相：为液体或气体，必须与固定相互不相溶,1.3 基本类型色谱法的分离机制,1.3.2 分配色谱法,分配色谱法,1.3 基本类型色谱法的分离机制,1.3.3 离子交换色谱法,固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。,阳离子交换色谱示意图 1.固定离子；2.可交换离子 R.树脂骨架；m.流动相,1.3 基本类型色谱法的分离机制,1

16、.3.3 离子交换色谱法,要 求,固定相,流动相,被分离组分,离子型的有机物或无机物,离子交换树脂,水为溶剂的缓冲溶液,1.3 基本类型色谱法的分离机制,1.3.4 空气排阻色谱法,凝胶色谱分离示意图 Ge.凝胶； m.流动相,分离机理与其他色谱法完全不同：类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠相互作用力的不同来分离，而是按分子大小进行分离,1.3 基本类型色谱法的分离机制,1.3.4 空气排阻色谱法,固定相：多孔性凝胶,流动相,水,有机溶剂,凝胶过滤色谱,凝胶渗透色谱,毛细管电泳 高效液相色谱,生物大分子的分离和纯化,手性分离色谱,解决

17、药物对映异构体的分离,色谱高灵敏检测器,检测极微量环境污染物,高温毛细管 气相色谱法,适应石油化工的需要,有效快速地分离蛋白质和多肽,整体色谱法,1.4 色谱法发展趋势及应用,色谱法在食品工业中的应用,1.4 色谱法发展趋势及应用,色谱分离和检测手段日益丰富，分析物范围扩大同时，对传统分析物研究更为深入,样品介质日益复杂，样品前处理方法更加完善,分析方法标准化，分析目的进一步多样化,采用非抑制性离子交换色谱-间接紫外光度检测法，可在7min内测定啤酒、饮料、食盐和香肠中的Cl-，NO2-，NO3-，I- ， SO32- SO32-：亚硫酸盐用途广泛，农业上用作抑制剂，促进水稻、小麦、玉米、油菜

18、、棉花等农作物增产，食品工业作为食物、果品和饮料的防腐剂。许多国家严格规定其在产品中的含量水平，美国食品与药品管理局规定，任何产品亚硫酸盐含量等于或超过10mg/kg的必须加以标注,1.4 色谱法发展趋势及应用,无机阴离子,采用非抑制性离子交换色谱和离子排斥色谱法都可用来测定有机酸。通过对不同等级甜菜糖中无机阴离子和有机酸的分析，可把无机阴离子的含量作为判断甜菜糖结晶质量的标准，而把有机酸含量作为判断储藏温度和湿度是否适宜的标准。果汁中乙酸、乳酸含量的增加可作为微生物变化的标志。,1.4 色谱法发展趋势及应用,有机酸,形态分析，特别是金属和半金属有机化合物的分析是近年来分析化学的一个热点。离子色谱可分离同种元素不同的离子形式，是进行形态分析的有力工具。许多有机锗化合物都具有抗癌效果，但是其毒性具有差异，因此对结构相似的有机锗化合物进行分析十分重要。 针对日本等国报道“锗中毒”事件。采用离子排斥色谱-柱后衍生光度法，测定了保健饮品中的无机锗和锗132。,1.4 色谱法发展趋势及应用,形态分析,目前各种饮料和食品中人工合成甜味剂超限量和超范围使用的问题十分严重，以廉价甜味剂代替价高质优甜味剂的事情也时有发生。采用色谱方法可同时测定甜味素、甜蜜素、安赛蜜、糖精钠和柠檬酸。,1.4 色谱法发展趋