《生物化学》教学课件：第二章 多肽与蛋白质

1、多肽与蛋白质,第二章,Peptides and Proteins,1833年，Payen和Persoz分离出淀粉酶。 1864年，Hoppe-Seyler从血液分离出血红蛋白，并将其制成结晶。 19世纪末，Fischer证明蛋白质是由氨基酸组成的，并将氨基酸合成了多种短肽 。 1938年，德国化学家Gerardus J. Mulder引用“Protein” 一词来描述蛋白质。,1951年, Pauling采用X（射）线晶体衍射发现了蛋白质的二级结构-螺旋(-helix)。 1953年，Frederick Sanger完成胰岛素一级序列测定。 1962年，John Kendrew和Max Per

2、utz确定了血红蛋白的四级结构。 20世纪90年代以后，后基因组计划。,什么是蛋白质?,蛋白质（protein）是由许多氨基酸（amino acids）通过肽键（peptide bond） 相连形成的高分子含氮化合物。,分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。 含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。,蛋白质的生物学重要性,1. 蛋白质是生物体重要组成成分,1）作为生物催化剂（酶） 2）代谢调节作用 3）免疫保护作用 4）物质的转运和存储 5）运动与支持作用 6）参与细胞间信息传递,2. 蛋白质具有重要的

3、生物学功能,3. 氧化供能,肽和蛋白质的一级结构,第一节,Primary Structure of Peptides and Proteins,（一）氨基酸通过肽键相连形成肽/蛋白质,存在自然界中的氨基酸有300余种，组成体内蛋白质的氨基酸（amino acid）有20种，均为L-氨基酸（除甘氨酸外） 。,、肽和蛋白质是由氨基酸组成的多聚体,蛋白质是由若干氨基酸的氨基与羧基经脱水缩合而连接起来形成的长链化合物。 一个氨基酸分子的-羧基与另一个氨基酸分子的-氨基在适当的条件下经脱水缩合即生成肽。,两氨基酸单位之间的酰胺键，称为肽键。 多肽链中的氨基酸单位称为氨基酸残基。 多肽链具有方向性，头端为

4、氨基端（N端），尾端为羧基端（C端）。 多肽链从氨基末端走向羧基末端。,由数个、十数个氨基酸组成的肽习惯称为寡肽(oligopeptide)，而很多氨基酸组成的肽称为多肽（polypeptid）。 凡氨基酸残基数目在50个以上，且具有特定空间结构的肽称蛋白质； 凡氨基酸残基数目在50个以下，且无特定空间结构者称多肽。,（二）生物活性肽：,生物体内具有一定生物学活性的肽类物质称生物活性肽。 重要的有谷胱甘肽、神经肽、肽类激素等。,1.谷胱甘肽是体内重要的还原剂,谷胱甘肽（GSH）： 全称为-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。其巯基可氧化、还原，故有还原型（GSH）与氧化型（GSSG）两种存在形式。,谷胱甘肽

5、的生理功用： 解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用；生物转化。 参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应； 保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态； 维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。,2. 多肽类激素： 多肽类激素：种类较多，生理功能各异。 主要见于下丘脑及垂体分泌的激素。 催产素，加压素，促肾上腺皮质激素。,3.神经肽,神经肽：在神经传导过程中起信号转导作用的肽类。 脑啡肽，强啡肽，孤啡肽，物质（10肽） 用于临床镇痛治疗。,二、蛋白质的分子组成和结构,蛋白质分子中主要的元素组成是：C、H、O、N、S等。C（5055%）、

6、H（67%）、O（1924%）、N（1319%）、 S（04%）、 有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘 。,蛋白质是体内的主要含氮物。 其中N元素的含量相对稳定，约为16%，故每克氮相当于6.25克蛋白质。 N的含量平均为16%凯氏定氮法（Kjadehl）的理论基础,(一)蛋白质的分类,1. 蛋白质根据分子组成分为单纯蛋白质和结合蛋白质两类：,2. 蛋白质根据结构特点进行分类 ： 将具有相同或类似结构域或模体的蛋白质归为一类。既体现结构特性又提示功能特性。,超家族（super family） 家族（family） 亚家族（subfamily）,3. 蛋白质

7、根据其形状 可分为： 纤维状蛋白质：结构蛋白，难溶于水。如结缔组织中的胶原蛋白 球状蛋白质：易溶于水，功能蛋白。,(二)蛋白质分子结构可区分为4个层次,高级结构 或 空间构象(conformation),一级结构(primary structure) 二级结构(secondary structure) 三级结构(tertiary structure) 四级结构(quaternary structure),构象是由于有机分子中单键的旋转所形成的。 蛋白质的构象通常由非共价键（次级键）来维系。,三、蛋白质的一级结构,肽键（主要化学键） 二硫键,蛋白质一级结构(primary structure)是

8、指蛋白质分子中，从N端到C端的氨基酸排列顺序。 形成一级结构的化学键：,胰岛素（Insulin）由51个氨基酸残基组成，分为A、B两条链。A链21个氨基酸残基，B链30个氨基酸残基。A、B两条链之间通过两个二硫键联结在一起，A链另有一个链内二硫键。,四、蛋白质一级结构比对可用于同源 蛋白质分析,蛋白质一级结构（氨基酸序列）比对常被用来预测蛋白质之间结构与功能的相似性。,序列比对方法（sequence-comparison method）关键在于将2个序列准确地对齐，使之达到相同序列最大化，插入或删除序列最小化的目的。 然后计算相同的氨基酸数。,同源蛋白质：仅指同一基因进化而来的蛋白质。 相似（

9、analogy）序列：序列相似，但非进化相关的2个蛋白质的序列，常被称为相似序列 。 不同种属有同样功能的蛋白质，活性部位的氨基酸是保守的，进化过程中，变化较少或基本不变。,第二节 肽、蛋白质的高级结构,Three Dimentional Structure of Peptides and Proteins,一、蛋白质的二级结构,蛋白质的二级结构是指蛋白质多肽链主链原子（氨基N、 -碳原子、羰基碳）局部的空间结构，不包括与其他肽段的相互关系及侧链构象的内容。 维系蛋白质二级结构的主要化学键是氢键。,（一）肽单元,1.由于C=O（羰基）双键中的电子云与N原子上的未共用电子对发生“电子共振”，使肽

10、键具有部分双键的性质，不能自由旋转。 2.与肽键相连的六个原子构成刚性平面结构，称为肽单元或肽键平面。 但由于-碳原子与其他原子之间均形成单键，因此两相邻的肽键平面可以作相对旋转。,肽键平面由于肽键具有部分双键的性质，使参与肽键构成的六个原子被束缚在同一平面上，这一平面称为肽键平面或肽单元。,（二）蛋白质二级结构的类型：,蛋白质的二级结构主要包括-螺旋，-折迭，-转角及无规卷曲等几种类型。,1. -螺旋： -螺旋是多肽链的主链原子沿一中心轴盘绕所形成的有规律的螺旋构象，其结构特征为： 走向为顺时针方向，为一右手螺旋； 螺旋每圈包含3.6个氨基酸残基， 螺距为5.44埃；, 螺旋以氢键维系。每个

11、肽键N-H的和第四个肽键的羰基氧形成氢键； （） -螺旋常具两性特点，几个疏水性氨基酸组成的肽段和几个亲水性氨基酸组成的肽段交替出现，使之能在极性和非极性环境中存在。 毛发的角蛋白，肌肉的肌球蛋白，血凝块中的纤维蛋白 ，它们的多肽链几乎都卷曲成-螺旋。具较好的伸缩性。,-折迭是由若干肽段或肽链排列起来所形成的扇面状片层构象，其结构特征为： 由若干条肽段或肽链平行或反平行排列组成片状结构； 主链骨架伸展呈锯齿状； 借相邻肽链主链肽键羰基氧和亚氨基氢之间形成的氢键维系。 蚕丝蚕蛋白几乎都是-折迭,2. -折迭：,-折迭包括平行式和反平行式两种类型,3. -转角：,-转角是多肽链180回折部分所形成

12、的一种二级结构，其结构特征为： 主链骨架本身以大约180回折; 回折部分通常由四个氨基酸残基构成; 构象依靠第一残基的-CO基与第四残基的-NH基之间形成氢键来维系。,4. 无规卷曲：,无规卷曲是指多肽链主链部分形成的无规律的卷曲构象。 蛋白质的二级结构不同形式间在一定条件下可以转变。毛发水蒸气拉伸-螺旋可变成-转角,RNase的分子结构,-螺旋,-折迭,-转角,无规卷曲,（三）模体（motif) 在许多蛋白质分子中可发现二个或三个具有二级结构的肽段 ，形成一个具有特殊功能的空间结构被称为模体或超二级结构。 一个模体总有其特征性的氨基酸序列，并发挥特殊的功能。,锌指结构是一个常见的模体。 由一

13、个-螺旋和两个反向平行的-折迭组成，形似手指。 端两个半胱氨酸，端两个组氨酸，此四个氨基酸残基在空间上构成一个洞穴，容纳一个锌，具结合锌离子功能。 含锌指结构的蛋白质都可与或结合。,锌指结构 (折迭-折迭模序),亮氨酸拉链结构：,见于真核生物DNA结合蛋白质的C端，与癌基因表达调控有关。 由两段-螺旋平行排列构成，其-螺旋中存在每隔7个残基规律性排列的Leu残基，Leu侧链交替排列而呈拉链状。两条肽链呈钳状与DNA结合。,（四）氨基酸侧链对二级结构形成的影响 影响-螺旋稳定的因素有： 极大的侧链基团（存在空间位阻）； 连续存在的侧链带有相同电荷的氨基酸残基（同种电荷的互斥效应）； 有Pro等亚

14、氨基酸存在（不能形成氢键）。 (4)Gly:由于自由度过大而不稳定。,二、蛋白质三级结构,蛋白质的三级结构(tertiary structure)是指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置，包括一级结构中相距甚远的肽段的空间位置关系。,（一）三级结构是指整条多肽链的空间分布,肌红蛋白 (Mb),肌红蛋白（myoglobin）是一个单个肽链的球状蛋白质，由153个氨基酸残基构成，含有1个血红素（heme）辅基。,(二) 维持三级结构稳定主要依靠非共价键,蛋白质三级结构的形成和稳定主要靠弱的相互作用力或称非共价键、次级键， 主要有氢键、范德华力（Van der

15、 Waals force）、疏水作用（hydrophobic interactin）和盐键（salting bond）（又称离子键）等。,1. 氢键： 氢键(hydrogen bond)的形成常见于连接在一电负性很强的原子上的氢原子，与另一电负性很强的原子之间。 氢键在维系蛋白质的空间结构稳定上起着重要的作用。 氢键的键能较低(12kJ/mol)，因而易被破坏。 氢键的作用是：协同蛋白质的折叠 帮助稳定球蛋白的天然构象。,蛋白质分子中氢键的形成,2. 疏水键： 非极性物质在含水的极性环境中存在时，会产生一种相互聚集以避开水的力，这种力称为疏水键或疏水作用力。 蛋白质分子中的许多氨基酸残基侧链也

16、是非极性的，这些非极性的基团在水中也可相互聚集，形成疏水键。 疏水相互作用在维持蛋白质构象中起着主要的作用。 非极性侧链避开水聚集被压迫到蛋白质分子内部，而大多数极性侧链在蛋白质表面维持着与水的接触。,3. 离子键（盐键）： 离子键(salt bond)是由带正电荷基团与带负电荷基团之间相互吸引而形成的化学键。 在近中性环境中，蛋白质分子中的酸性氨基酸残基侧链电离后带负电荷，而碱性氨基酸残基侧链电离后带正电荷，二者之间可形成离子键。能帮助稳定球蛋白，虽然这种作用很弱。 离子化的侧链一般都出现在球蛋白的表面，所以是溶剂化的。 对于整个球蛋白的稳定性的贡献是最小的,4范德华氏（van der Wa

17、als)引力,范德华力包括吸引力和斥力两种相互作用，范德华力只有当两个非极性残基之间处于一定距离时才能达到最大。 虽然范德华力相对来说比较弱，但由于范德华力相互作用数量大，并且具有加和性，因此范德华力对球蛋白的稳定性也有贡献。,（三）结构域,分子量大的蛋白质三级结构，常常可分割成数个结构紧密的球状或纤维状区域。 这些区域在功能上相对独立，由几个超二级结构单位汇集在一起组成，形成发挥生物学功能的特定区域， 称为结构域（domain）。,结构域(domain)在空间上相对独立,免疫球蛋白,（四）根据结构域可对蛋白质进行分类：,根据结构域可将球状蛋白质分为4类： 反平行螺旋结构域（全-结构） 平行或

18、混合型折叠片结构域（，-结构） 反平行折叠片结构域(全-结构) 富含金属或二硫键结构域（不规则小蛋白质结构）,（五）分子伴侣,除一级结构外，蛋白质空间构象的正确形成还需分子伴侣（molecular chaperon）。 有些蛋白质被合成以后，自己不能独立形成自由能最低的稳定立体结构，而需要一类蛋白质来催化，这类蛋白质称为分子伴侣。许多分子伴侣是ATP酶。 它们普遍存在于真核生物和原核生物中，一般使用ATP的能量帮助其它蛋白质形成自由能最低的立体结构，但不改变自己。,分子伴侣可分为3类： 热激蛋白70(Hsp70)：Hsp70在真核和原核生物中高度保守，它可部分逆转变性或聚集的蛋白质 。 伴侣蛋

19、白(chaperonin)：伴侣蛋白普遍存在于细菌、线粒体、叶绿体和真核生物，主要有2个家族：热激蛋白60( Hsp60)和Hsp10。 核质蛋白(nucleoplasmin),各亚基间的结合力主要是氢键和离子键。,三、多亚基的蛋白质具有四级结构形式,蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。,体内有许多蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基 (subunit)。,（一）具有四级结构形式的蛋白质由多亚基组成,血红蛋白的四级结构,（二）亚基通过亚基间的相互作用联系在一起,由2个亚基组成的蛋白质四级结构中，若亚基分子

20、结构相同，称之为同二聚体(homodimer)，若亚基分子结构不同，则称之为异二聚体(heterodimer)。,（三）生物体内有很多由多亚基组成的蛋白质,生物体内许多蛋白质往往由多个亚基组成，亚基之间凭借次级键形成蛋白质四级结构。,胰岛素受体：由4个亚基组成(22) ，亚基与亚基形成单体(monomer)，2个单体形成二聚体(dimer)。,血红蛋白的一、二、三、四级结构,蛋白质结构与功能的关系Structure and Function of Proteins,第三节,（一）一级结构是空间构象的基础,一、蛋白质一级结构是高级结构与功能的基础,通过研究ribonuclease (核糖核酸酶)

21、的变性和重折叠证明氨基酸序列可以决定蛋白质最后的三维结构。 用尿素和巯基乙醇处理核糖核酸酶，破坏次级键和二硫键，空间结构被破坏，但肽键不受影响，一级结构还存在，酶活性丧失。 用透析方法去除尿素和巯基乙醇，二硫键正确配对，肽链折叠成天然酶的空间构象。酶恢复活性。,牛核糖核酸酶一级结构与空间结构的关系,（二）一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能 不同的哺乳动物胰岛素都由A、B两条链组成,一级结构相似,仅个别氨基酸差异., 氨基酸残基序号 胰岛素 A8 A9 A10 B30 人 Thr Ser Ile Thr 牛 Ala Ser Val Ala 猪 Thr Ser Ile Ala 羊 Ala

22、 Gly Val Ala 马 Thr Gly Ile Ala 狗 Thr Ser Ile Ala ,促肾上腺皮质激素(ACTH)和促黑激素(-MSH, -MSH)共有一段相同的氨基酸序列，因此，ACTH也可促进皮下黑色素生成，但作用较弱。,(三)氨基酸序列提供重要的生物化学信息,一些广泛存在于生物界的蛋白质如细胞色素(cytochrome C)，比较它们的一级结构，可以帮助了解物种进化间的关系。,（四）重要蛋白质氨基酸序列的改变可引起疾病,例：镰刀形红细胞贫血,这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。,二、蛋白质空间结构与功能的关系,（一）肌红蛋白和血红蛋白的结构,血红蛋白、肌红

23、蛋白是氧的运载体，分别存在于红细胞和肌肉中。,一级结构不同, 但空间构象极为相似,1肌红蛋白的结构,肌红蛋白只有三级结构单链蛋白,含血红素辅基。它是典型的球形蛋白质，高度折叠成紧密结构，疏水氨基酸残基大部分埋藏在分子内部，极性残基在表面。 肌红蛋白中有8条-螺旋。由多肽的折叠形成的疏水空隙内是血红素辅基，通过肽链上的His残基与肌红蛋白分子内部相连，它对肌红蛋白的生物活性是必需的（与O2结合）。,肌红蛋白的三级结构,2 血红蛋白的结构,脊椎动物的Hb由4个多肽链亚基组成，其中2个是一种亚基，2个是另一种亚基。 如成人的血红蛋白主要是HbA，亚基组成为22，每个血红蛋白分子都有4个血红素，每个血

24、红素分别位于每个多肽链中的裂隙处，并暴露在分子的表面。 血红蛋白（Hb）的主要功能是在血液中结合并转运氧气，它存在于红细胞中。,脱氧Hb亚基之间的八对盐键,（二）血红蛋白的构象变化与结合氧,1、肌红蛋白（Mb）与血红蛋白（Hb）的氧解离曲线,Hb和Mb都能可逆地与O2结合，其氧解离曲线，前者为S状曲线，后者直角双曲线。 Mb易与氧结合， Hb在氧分压低时较难。 根据S状曲线特点，第一个亚基与氧结合后促进第二和第三亚基及第四亚基与氧结合。,2、协同效应：一个亚基与其配体（Hb中的配体为O2）结合后，能影响此寡聚体中另一亚基与配体的结合能力。 如果是促进作用则称为正协同效应（positive co

25、operativity）；反之则为负协同效应（negative cooperativity）。,肌红蛋白 对氧的亲和力比血红蛋白的高,血红蛋白 血红蛋白与氧的结合是协作的,协同效应,3、血红蛋白与氧结合的机制,1.未与O2结合的4个亚基靠彼此形成盐键而紧密结合紧张态（T 态 tense state). 此时的血红蛋白与O2结合能力小；当第一个亚基与O2结合而破坏了该亚基与其相邻亚基间的盐键，结构开始松散，便于第二个亚基与O2结合，使结构更松散由T态转变为松弛态R态。四个亚基全处于R态。 2.脱氧Hb的Fe2+半径大，结合氧后其半径变小，引起相关肽段的一系列微小的变化，使得亚基间盐键断裂，Hb结

26、构变松散。,脱氧Hb为T型结构,氧合Hb为R型结构,氧连接导致血红素构象的变化,4、变构效应,当血红蛋白的一个亚基与氧分子结合以后，可引起其他亚基的构象发生改变，对氧的亲和力增加，从而导致整个分子的氧结合力迅速增高，使血红蛋白的氧饱和曲线呈“S”形。这种由于蛋白质分子构象改变而导致蛋白质分子功能发生改变的现象称为变构效应。 某些代谢物能与变构酶分子上的变构部位特异性结合，使酶的分子构象发生改变，从而改变酶的催化活性以及代谢反应的速度，这种调节作用就称为变构调节(allosteric regulation),血红蛋白(Hb)是一种变构蛋白,O2, CO2, H+,变构效应剂,亚基间的相互作用,构

27、像改变,脱氧Hb,氧合Hb,（三）蛋白质构象改变与疾病,由于蛋白质构象的改变而引起的疾病称为蛋白质构象病。 如：当蛋白质由于折叠错误而相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀。可导致人类纹状体脊髓变形病、老年痴呆、亨丁顿舞蹈病（Huntington disease）、疯牛病,疯牛病,疯牛病是阮病毒蛋白（prion protein, PrP）引起的人和动物神经退行性病变。这类疾病具有传染性、遗传性或散在发病的特点。 其在动物间的传播是由PrP组成的传染性颗粒（不含核酸）完成的。 PrPc 为基因正常编码蛋白，水容性好，对蛋白酶敏感，二级结构为多个-螺旋。,PrPsc 为致病蛋白。在某种未知的

28、蛋白质作用下，富含-螺旋的PrPc 全转变为-折迭的致病PrP 叫PrPsc 。 PrPsc水容性差，对蛋白酶不敏感，对热稳定，可以相互聚集，最终形成淀粉样纤维沉淀而致病 。 PrPc与PrPsc 一级结构完全相同。,一条肽链对应一个特定的空间结构 这条法则的破坏是灾难性的。疯牛病的prion就是一个例子。,正常prion,异常prion,第四节,蛋白质的理化性质 Chemical and Physical Properties of Proteins,一、蛋白质具有两性电离性质,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的

29、基团。,当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。,蛋白质的等电点( isoelectric point, pI),蛋白质在等电点的溶解度最小,二、蛋白质具有胶体性质,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之间，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。,蛋白质胶体稳定的因素： 颗粒表面电荷 水化膜,水化膜,溶液中蛋白质的聚集和沉淀,三蛋白质的变性、沉淀和凝固：,在某些物理或化学因素的作用下，蛋白质严格的空间结构被破坏（不包括肽键的断裂），从而引起蛋白质若干理化性质和生物学性质的改变，称为蛋白质的

30、变性(denaturation)。 蛋白质的变性主要发生在二硫键和非共价键的破坏，不涉及一级结构中氨基酸序列的改变。,引起蛋白质变性的因素有：, 物理因素：高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波等； 化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等。,变性蛋白质的性质改变： 物理性质：旋光性改变，溶解度下降，沉降率升高，粘度升高等； 化学性质：官能团反应性增加，易被蛋白酶水解。 生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原性改变。,应用举例 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。 此外, 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,蛋白质变性的可逆性：复性 复性：若蛋白质变性程度轻，去除

31、变性因素后，有些蛋白质可恢复或部分恢复其原有的构象和功能。 1） 蛋白质在体外变性后，绝大多数情况下是不能复性的； 2） 如变性程度浅，蛋白质分子的构象未被严重破坏；或者蛋白质具有特殊的分子结构，并经特殊处理则可以复性。,核糖核酸酶的变性与复性,沉淀、凝固,蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀。 变性后的蛋白质由于疏水基团的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白质不一定都是变性后的蛋白质。 加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固。因此，凡凝固的蛋白质一定发生变性。,四、蛋白质在紫外光谱区有特征性吸收峰,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的O

32、D280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,五、蛋白质呈色反应可用于溶液蛋白质测定,（一）蛋白质经水解后产生茚三酮反应,蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应(ninhydrin reaction) 。,（二）肽链中的肽键可与双缩脲试剂反应,蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应(biuret reaction) 。 双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。,蛋白质的分离、纯化、鉴定和结构分析 Isolation, Purification, Identification and Structural Analysis of Prote

33、ins,第五节,利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法叫透析。 1 可分离蛋白质和小分子物质， 2透析袋外放吸水剂如聚乙二醇，袋内水伴同小分子物质透出袋外，蛋白质可达到浓缩目的。 利用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。叫超滤法,一透析及超滤,二、常用的蛋白质沉淀方法,丙酮沉淀，必须在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。 沉淀原理是： 脱水作用； 使水的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。,盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋

34、白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。 常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。 盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。 盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。,将某一纯化蛋白质免疫动物，可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。,免疫沉淀法（immunoprecipitation）,三、电泳是蛋白质分离与鉴定的常用方法,蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctr

35、ophoresis) 。 根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。,几种重要的蛋白质电泳 SDS-PAGE,SDS是一种阴离子型去污剂，在蛋白质溶解液中加入SDS和巯基乙醇后，与SDS结合的蛋白质带有一致的负电荷；巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原。 SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。 蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度，也就是蛋白质相对分子质量的函数。,等电聚焦电泳： 等电聚焦电泳是根据两性物质等电点（pI）不同而进行分离的一种电泳技术，具有极高的分辨率，可以分辨出等电点相差0.01的蛋白质。 等电聚焦主要用于蛋白

36、质的分离分析，但也可以用于纯化制备。,聚丙烯酰胺凝胶双向电泳（2D-PAGE）,利用蛋白质的等电点和分子量的差异，通过双向凝胶电泳的方法将各种蛋白质分离开。 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的双重优点。 第一向电泳是等电聚焦，在细管中进行，蛋白质根据其等电点不同进行分离。 而后将凝胶从管中取出，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行第二向电泳。在第二向电泳过程中，蛋白质依据其分子量大小进行分离 。 由于双向电泳具有很高的分辨率，它可以直接从细胞提取液中检测某个蛋白 。,Two-dimensional gel electrophoresis, a techniq

37、ue for separating proteins based on their charge and their mass.,双向电泳,等电聚焦 SDSPAGE,蛋白质组学技术,四、应用相分配或亲和原理可将蛋白质进行层析分离,待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。,层析(chromatography),离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不

38、同分离。,蛋白质分离常用的层析方法,凝胶过滤分离蛋白质,五、利用蛋白质颗粒沉降行为不同可进行超速离心分离,超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。,蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示，沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 。,因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量。 但对分子形状高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。,六、用化学或反向遗传学方法可分析或演绎多肽链的氨基酸序列,蛋白质一级结构的测定,测定多肽链的数目,蛋白质测序 的步骤,拆

39、分多肽链,断开多肽链内的二硫键,测定每一肽链的氨基酸组成,鉴定多肽链的N-末端和C-末端,裂解多肽链为较小的肽段,测定各肽段的氨基酸序列,利用重叠肽重建完整多肽链的一级结构,确定二硫键的位置,一）、氨基酸顺序分析,蛋白质多肽链的氨基酸顺序分析，即蛋白质一级结构的测定，主要包括以下几个步骤： 1. 分离纯化蛋白质，得到一定量的蛋白质纯品。 2. 取一定量的样品进行完全水解，再用氨基酸自动分析仪，测定蛋白质的氨基酸组成。各氨基酸的含量，不是序列。,蛋白质的氨基酸组成分析,3. 分析蛋白质的N-端和C-端氨基酸。,Sanger采用2,4-二硝基氟苯（DNFB）法确定蛋白质的N-端氨基酸。 2,4-二

40、硝基氟苯与多肽链的a-氨基生成二硝基苯氨基酸，后将多肽水解，分离出二硝基苯氨基酸。 现多用丹酰氯生成丹酰衍生物，具荧光，易鉴别。 用羧肽酶将C-端氨基酸水解确定蛋白质的C-端氨基酸。,2,4-二硝基氟苯（DNFB）法分析N-端氨基酸残基,4. 采用特异性的酶（如胰蛋白酶）或化学试剂（如溴化氰）将蛋白质裂解成为长短不一的若干条肽段（至少作两套）。 溴化氰：水解蛋氨酸羧基侧的肽键。 胰蛋白酶（trypsin)的裂解作用：水解芳香族氨基酸羧基侧的肽键,胰蛋白酶（trypsin)的裂解作用：水解芳香族氨基酸羧基侧的肽键,5. 分离纯化单一肽段 6. 使用氨基酸顺序测定仪，测定各条肽段的氨基酸顺序。 一

41、般采用Edman降解法: 由埃德曼（PEdman）在上世纪50年代所创立。1)用异硫氰酸苯酯进行反应，只与游离的a-氨基作用; 2)后用冷稀酸处理，氨基末端的氨基酸脱落，成异硫氰酸苯酯衍生物; 3)用层析鉴定。后面的肽链a-氨基继续与异硫氰酸苯酯反应; 特点：从N-段依次对氨基酸进行鉴定,Edman降解法测定氨基酸序列,异硫氰酸苯酯,7. 将两套不同肽段的氨基酸顺序进行比较，以获得完整的蛋白质分子的氨基酸顺序。,二）通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列：,按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列,分离编码蛋白质的基因,测定DNA序列,排列出mRNA序列,七、应用物理学、生物信息学原理可进行蛋白质空间结构测定或预测,通常采用圆二色光谱(circular dichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。 -螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198nm处的正峰3个成分； 而-折叠的CD谱不很固定。,（一）圆二色光谱可估算蛋白质二级结构比例,X射线衍射法(X-ray dif