生物检测技术多抗和单抗综述

1、多克隆抗体与单克隆抗体 的制备,三、半抗原免疫原的制备,1.半抗原（hapten) ：仅有抗原性而无免疫原性的物质低分子量的化学物质。例如多糖、多肽、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、某些药物(包括抗生素）及其他化学物品等。 2.载体 (carrier)：赋予半抗原以免疫原性的物质；蛋白质、多肽聚合物、大聚合物；,第一节 半抗原免疫原的制备,载体类型,1.蛋白质：人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔 血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白等。,载体类型,2.多肽聚合物：人工合成的，常见的有多聚赖 氨酸，其分子量大（可达十几万到几十万)， 这种多聚物和半抗原结合后，可刺激免疫动 物产生高效价、高亲和力的抗体。,3.

2、大聚合物：羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮 等，可与半抗原结合，加入弗氏完全佐剂亦 可诱发动物产生抗体。,物理方法：利用通过电荷和微孔吸附半抗原 吸附的载体有羧甲基纤维素 （ CMC）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、硫酸葡聚糖等,3、半抗原与载体的连接方法,化学方法：利用某些功能基团将半抗原连接到载体上 带有游离氨基或羧基以及两种基团都有的半抗原：碳二亚胺法 戊二醛法 混和酸酐法 不带氨基和羧基的半抗原：用化学方法使其转变为带有游离氨基或游离羧基的衍生物，再与载体连接 - 琥珀酸酐碳二亚胺法,第二节、多克隆抗体（polyclonal antibody, PcAb） 将由多种抗原成分组成的抗原物质，采用

3、传统方法免疫接种实验动物后采集免疫血液，分离所得到的抗血清即为多克隆抗体。,抗血清的制备是将制备好的免疫原按照一定的免疫程序接种给所选择的动物，该动物在含有多种抗原表位的抗原刺激下，体内多个B细胞克隆被激活并产生针对某一抗原多种不同表位的抗体，其混合物为多克隆抗体。,免疫血清的制备,1.免疫动物选择 2.免疫方法 3.动物采血法 4.免疫血清的分离及保存,能作免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。 1.抗原与免疫动物种属差异越远越好。 2.动物必须适龄、健壮、无感染。 3.动物体内有与抗原相类似的物质或其它原因而使该抗原对该动物免疫原性极差，则该动物不能选用。例如：

4、IgE绵羊，胰岛素-家兔，酶类-山羊等。 4.抗血清的用量 5.抗血清的要求：例如，马型抗血清用于沉淀反应时较难掌握，因而极少应用。,一、免疫动物选择,常用的免疫动物,兔子（rabbit）：最常用于自制抗体，抗体量较多。（新西兰,大耳白） 小鼠（mouse）：可用于自制抗体，但抗体量很少。（BALB/C,昆明鼠） 大鼠（rat）：可用于自制抗体，免疫过程要麻醉动物。（Wistar大鼠） 羊（sheep、goat）：常用于较大批量地生产抗体（商品）。 马（horse）：常用于大批量生产治疗用抗体（商品）。 豚鼠（guinea pig）：酶类免疫常用。,3.免疫方案 全量免疫法：弗氏佐剂抗原多次注

5、射 微量免疫法：卡介苗7天弗氏佐剂1月 抗原 混合免疫法：综合皮下、淋巴结和静脉,二、免疫方法,1.免疫原的注射剂量 大:0.51mg/只，小:0.10.6mg/只,2.免疫途径：免疫反应产生速度依次为静脉 腹腔肌肉皮下皮内淋巴结足掌,免疫间隔时间 第一次和第二次间隔1020天，三次及以后间隔710天；,采集免疫血清前，要预先测试抗体效价测定，若效价达到要 求，应在末次免疫后一周及时采血，否则抗体效价会下降。 (1) 颈动脉采血法; 最常用的方法，家兔、山羊等动物 ； (2) 心脏采血法; 用于豚鼠、大鼠、鸡等小动物，要求操作熟练， (3) 静脉采血法;家兔可用耳中央静脉，山羊可用颈静脉；,三

6、、动物采血法,四、免疫血清的分离和保存,1、 收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。 2、 56 30min灭活在无菌条件，吸出血清，分装（0.050.2ml）；,1.4保存：可保存36个月 2.低温保存：-20-40，可保存23年 3.冰冻干燥保存：可保存35年,四、免疫血清的分离和保存,多抗的纯化与鉴定,抗原免疫动物制备的抗血清是成分复杂的混合物，除含有特异性抗体外，还存在与目的抗体不相关的成分。纯化目的是除去这些不相关成分，防止抗血清中其他杂抗体干扰试验结果。,盐析法（硫酸铵沉淀) 辛酸-硫酸铵沉淀法 离子交换法 亲和层

7、析法 凝胶过滤法,1、盐析法（硫酸铵沉淀),原理 在高浓度中性盐存在下，蛋白质在水中的溶解度降低而产生沉淀； 硫酸铵是最常用的中性盐; 不同蛋白质的盐析常数不同; 硫酸铵的加入量通常以饱和度表示; (100%饱和度:767g/L),主要步骤 在血清或腹水中加入硫酸铵使抗体沉淀； 4高速离心,弃上清,溶解沉淀； 可反复操作,逐级降低硫酸铵的浓度: 50%饱和度: 0.313g/ml 45%饱和度: 0.277g/ml 40%饱和度: 0.243g/ml 最后一次离心后,用少量PBS溶解沉淀,透析,测定浓度。,特点 成本低，步骤简单。 抗体的回收率比较高。 抗体纯度比较低，电泳后可见到明显的杂带,

8、不适合于做各种标记。 需要高速离心机。,2、正辛酸-硫酸铵沉淀法,原理 两步沉淀： 先加正辛酸去杂蛋白: 正辛酸是一种有机酸,在酸性条件下(pH4.5)可使大分子的杂蛋白沉淀. 后加硫酸铵使抗体沉淀。,主要步骤： 血清滤纸过滤去沉淀和脂质，滤液用4倍体积60mmo1/ L醋酸缓冲液(pH4.0)稀释后，用Na0H调，PH值至4.5。 逐滴加入辛酸(终浓度25u1/ml)，室温h搅拌30分钟后，以6000-8000r/min.离心30分钟，收集上清液。 上清液经滤纸过滤2次，将滤液与10*PBS(0.lmol/L，pH7.4按10:1比例混合，调pH至7.4,置冰浴冷至40度。 每毫升上述混合液

9、加0.2778固体硫酸钱，40度搅拌30分钟，以4000-6000r/min离心巧一20分钟，将沉淀溶于少量YBS，透析，测蛋白含量，冻存。,特点 成本较低，步骤较复杂。 抗体回收率很低。 抗体纯度高，电泳后杂带很少，适合于各种标记。 需要高速离心机，耐高速离心的玻璃离心管。,3、离子交换法,原理 利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离； DEAE是一种阴离子交换剂，自身带正电荷 (Diethylaminoethyl,二乙氨基乙基)； 将样品的pH值调至等电点以上,使样品带负电荷； 采用盐溶液洗脱,通过高浓度的带同种电荷的离子(Cl-)置换被分离的组分。,+,+,+,+

10、,+,- - - - - - - -,带负电荷 的被吸附上,带负电荷少 的先被置换,带负电荷多 的后被置换,NaCl Tris 梯度混合仪,连续梯度洗脱:,阶段洗脱:,T,离子强度,蛋白浓度,T,倒入一定浓度的NaCl溶液,通过离心来分离,主要步骤 先用硫酸铵沉淀抗体，粗提； 将样品过柱； 洗去没有结合的物质； 用梯度NaCl溶液洗脱，等量收集洗脱液； 紫外分光光度计测量，保留A280值明显升高的样品； 汇集样品，浓缩，测定浓度。,图3 在DEAE-纤维素上人血清蛋白的层析示意图 (M=IgM, G=IgG, A=IgA),特点 成本较低，步骤较简单。 抗体回收率较高。 抗体纯度较高，电泳后可

11、见少量杂带，适合于各种标记。 纯化后抗体体积大，需要浓缩。 需要冷柜，自动收集器。,4、亲和层析法,原理 利用蛋白质之间的特异性结合 （抗体-抗原，受体-配体） 将一种配基与凝胶颗粒结合,捕捉与它相配的物质。 洗脱一般采用改变pH值的方法,使用前,样品结合(Binding),洗脱(Elution),主要步骤 将Protein A与活化的柱子相结合(买商品柱)； 将腹水或血清处理后过柱； 用结合缓冲液洗柱子，直到A280值为零； 用甘氨酸缓冲液洗脱抗体，等量收集洗脱液； 测定洗脱液的A280值，保留A280值明显升高的样品； 汇集样品，浓缩，测定浓度。,葡萄球菌A蛋白 (staphylococc

12、al protein A,SPA) 金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白 分子量42000,等电点pH5.1 可与大多数动物Ig的Fc段结合 一个SPA分子有4个相似的活性部位 与IgG的结合最强,与IgM, IgA的结合较差,特点 成本高，步骤较简单。 抗体回收率低。 抗体纯度高，适合于各种标记。 纯化后抗体体积大，需要浓缩。 需要自动收集器。,5、凝胶过滤法(分子筛),原理 将样品混合物通过一定孔径的凝胶介质,由于流经路径的差异,使不同分子质量的组分分离. 大分子物质直接从凝胶颗粒外通过，走得快；小 分子物质进入凝胶颗粒的内部再出来，走得慢。 适合于IgM类抗体的纯化 (五聚体,分子量约800

13、KD),主要步骤 将腹水或血清处理后上柱,样品要浓； (可用G-200，柱子要长，80-100cm) 待样品入柱后,用缓冲液过柱； 等量收集洗脱液,测定洗脱液的A280值。 收集第一峰。,凝胶过滤法纯化抗体,血清蛋白的分级分离常用凝胶过滤法进行，按分子大小可分为三组： 第一组包括IgM和一些脂蛋白； 第二组主要是IgG和较少量的IgA、IgD、IgE等球蛋白； 第三组主要白蛋白、血清粘蛋白、铁传递蛋白等。,在凝胶过滤柱上血清蛋白的层析示意图 (M=IgM, G=IgG, A=IgA),特点 成本高，步骤较简单。 抗体回收率较高，分离条件缓和，抗体活性不受影响。 抗体纯度较高。 需要自动收集器。

14、,1.抗体效价的鉴定：即为抗体活性滴定,特异性抗体的鉴定,2.抗体特异性鉴定： 细菌类抗原的抗体用凝集试验 可溶性抗原的抗体用双向琼脂扩散试验,3.抗体的纯度鉴定：免疫电泳分析法,4.抗体亲和力鉴定：亲和力高则灵敏度好,第三节 单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb）,由单个B细胞增殖所产生的抗体，其遗传背景完全一致，因此，抗体分子的氨基酸序列、类型、抗原特异性等生物学性状均相同。,应用： 高效治疗剂 （抗病毒） 药物导弹（ McAb 与毒素偶联）（抗肿瘤）,具有高特异性、高纯度、效价高等优点。,McAb and PcAb,淋巴细胞杂交瘤技术生产单克隆抗体：,该技术由G

15、.Kohler、C.Milstein于1975年创建，1984年获诺贝尔奖。,免疫B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 （可分泌McAb ， （在体外能长期繁殖） 在体外不能长期繁殖） 细胞融合 杂交瘤细胞 （分泌McAb ，长期繁殖） 生长繁殖 产生McAb,杂交瘤技术原理： 聚乙二醇（PEG）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合 HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤细胞系 单克隆抗体生成：接种杂交瘤细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体,流 程,杂交瘤技术的原理及流程,动 物： BALB/c小鼠 712周龄 20g25g体重,动物免疫,细胞性抗原： （

16、12）107/只，不加佐剂，23周重复一次 可溶性抗原： 首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，36周100200微克抗原，融合前3天，加强免疫,免疫方法,B淋巴细胞的分离,免疫脾细胞的制备： 1108的淋巴细胞 无菌手术制备；,常用的小鼠骨髓瘤细胞株为SP20、NS1； 不产生Ig的重链和轻链 HGPRT-;TK-;次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、胸腺嘧啶核苷激酶； 与提供淋巴细胞的动物品系相同,骨髓瘤细胞,培养骨髓瘤细胞 选择对数生长期的细胞进行传代培养,细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐 避免细胞返祖：定期用8-氮鸟嘌呤 （8-AG）处理细胞。注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于

17、-80或液氮及干冰中,细胞融合剂： PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂； 作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合； 作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同； 常用培养液：RPM1640或DMEM培养液；,细胞融合,骨髓瘤细胞与B细胞(1:3) 50% PEG 1min内加完; 2min内加10ml培养液,细胞融合,1ml 50%的PEG（无菌，预温37）在1分钟内滴完,静置90秒,时间一到,将事先准备的培养液一滴一滴加入,停止PEG作用；根据细胞数量加入HAT培养基，使之分加到96孔板中时每孔细胞数为（0.5

18、1.5）105个。融合后7天，换用HT培养液。,细胞融合,致敏淋巴细胞,骨髓瘤细胞,离心 1000rpm 10min,50%PEG 1ml,培养液 10ml,离心 1000rpm 7min,37。C摇动、由慢渐快1min、静止1.5min,加入HAT培养液悬浮细胞，置于培养孔内,。,饲养细胞,1020天出现克隆 HAT筛选 挑克隆,融合细胞的早期培养,杂交瘤细胞的选择性培养,HAT培养基： H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤 A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNA,B

19、淋巴细胞:寿命短,分泌特异系性抗体 骨髓瘤细胞：寿命长 杂交瘤细胞：寿命长，单克隆抗体,HAT选择作用： 淋巴细胞：不能生长，57天死亡； 骨髓瘤细胞：不能生长，57天死亡；DNA合成的主要途径被A阻断;HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻。,杂交瘤细胞： 从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息； 从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力； 利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA, 可长期生长繁殖；,随机融合后的细胞类型,细胞组合 HGPRT 生长状态 淋巴细胞 + 骨髓瘤 + 长期生长 淋巴细胞 + 淋巴细胞 + 短期生长 骨髓瘤 + 骨髓瘤 不能生长 未融合淋巴细胞 +

20、 短期生长 未融合骨髓瘤 不能生长,有限稀释法(limiting dilution) 显微操作法(micromanipulation) FACS法（fluorescence activated cell sorter） 软琼脂平板法(soft agar method),阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存,特点： 不需任何特殊设备 克隆出现效率高 实验室常用方法 方法： 细胞悬液通过系列稀释 每个培养孔含0.51个细胞,有限稀释法,配制方案：杂交瘤细胞（15）x106/ml) + 细胞冻存液(30%40% 牛血清，50%60% RPMI-1640培养液，10%DMSO ) “慢冻”：分步冷冻，30-70液氮 “快融”：取出立即浸入3740水浴中，使其迅速融化、复苏,杂交瘤细胞的冻存与复苏,防止污染 避免染色体丢失 防止非分泌细胞的过度生长 防止细胞密度过高而死亡,细胞冷冻的意义,单克隆抗体的制备,经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制