3生物信息的传递从DNA到RNA.ppt

1、第三章 生物信息的传递（上）从DNA到RNA,1. 掌握生物信息的传递从DNA到RNA 整个转录的原理和过程 2. 掌握RNA转录的机制 3. 掌握转录产物的后加工,(1) DNA序列是遗传信息的贮存者，通过自主复制得到永存； (2) DNA通过转录生成RNA； (3) 含遗传信息的mRNA通过翻译生成蛋白质来控制生命现象； (4) 同时某些RNA可以通过逆转录将遗传信息传到DNA； (5) 某些RNA自身还可进行复制使其遗传信息得以永存。,中心法则 (central dogma),基因表达包括转录(transcription)和翻译(translation)两个阶段。 转录:指拷贝出一条与D

2、NA链序列完全相同(U替换T)的RNA单链的过程，是基因表达的核心步骤； 翻译:指以新生的mRNA为模板，把核苷酸三联遗传密码子翻译成氨基酸序列、合成多肽链的过程，是基因表达的最终目的。,编码链：与mRNA序列相同的那条DNA链称为编码链(coding strand)或称有意义链(sense strand)。 模板链：把另一条根据碱基互补原则指导mRNA合成的 DNA链称为模板链(template strand)或称反义链(antisense strand)。,模板链并非永远在同一条单链上,DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因。,结构基因：,贮藏在任何基因中的生物信息都必须首先被转录生

3、成RNA，才能得到表达。RNA主要以单链形式存在于生物体内，其高级结构很复杂，它们既担负着贮藏及转移遗传信息的功能，又能作为核酶直接在细胞内发挥代谢功能。,RNA分子来自DNA。储存于DNA双链中的遗传信息通过转录酶促反应按照碱基互补配对的原则被转化成为单链RNA分子。生物体内共有3种RNA： 、信使RNA(messenger RNA，mRNA)编码特定蛋白质序列； 2、转移RNA(transfer RNA，tRNA)特异性解读mRNA中的遗传信息、将其转化成相应氨基酸并将其加入多肽链中； 3、核糖体RNA(ribosomal RNA，rRNA)直接参与核糖体中蛋白质合成。,内容大纲,1、RN

4、A的转录 2、转录机器的主要成分 3、启动子与转录起始 4、原核生物与真核生物mRNA的特征比较 5、终止与抗终止 6、内含子的剪接、编辑及化学修饰,31 RNA的转录,311 转录的基本过程 无论是原核还是真核细胞，转录的基本过程都包括:模板识别、转录起始、通过启动子及转录的延伸和终止。,在原核生物中，模板识别阶段主要指RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。转录起始前，启动子附近的DNA双键分开形成转录泡以促使底物核糖核苷酸与模板DNA的碱基配对。转录起始就是RNA链上第一个核苷酸键的产生。,转录起始后直到形成9个核酸苷短链是通过启动子阶段。RNA聚合酶一直处于启动子区，

5、新生的RNA链与DNA模板链的结合不够牢固，很容易从DNA链上掉下来并导致转录重新开始。一旦RNA聚合酶成功地合成9个以上核苷酸并离开启动子区，转录就进入正常的延伸阶段。所以，通过启动子的时间代表一个启动子的强弱。,RNA聚合酶离开启动子，沿DNA链移动并使新生RNA链不断伸长的过程就是转录的延伸。37时，大肠杆菌RNA聚合酶完成速度为40个核苷酸/S。 随着RNA聚合酶的移动，DNA双螺旋持续解开，暴露出新的单链DNA模板，新生RNA链的3末端不断延伸，在解链区形成RNA-DNA杂合物。而在解链区的后面，DNA模板链与其原先配对的非模板链重新结合成为双螺旋。,当RNA链延伸到转录终止位点时，

6、RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂合物分离，转录泡瓦解，DNA恢复成双链状态，而RNA聚合酶和RNA链都被从模板上释放出来，这就是转录的终止。,真核生物RNA聚合酶不能直接识别基因的启动子区，需要转录调控因子(辅助蛋白质)按特定顺序结合于启动子上，RNA聚合酶才能与之相结合并形成复杂的前起始复合物（preinitiation transcription complex，PIC)。 转录和翻译的速度基本相等，37时，转录生成mRNA的速度为14个密码子/S，而蛋白质合成的速度大约是15个氨基酸/S。,32 转录机器的主要成分,321 RNA聚合酶 以DNA序列为模板的RNA聚合

7、酶主要以双链DNA为模板，以4种核苷三磷酸作为活性前体，以Mg2/Mn2为辅助因子，催化RNA链的起始、延伸和终止，它不需要任何引物，催化生成的产物是与DNA模板链互补的RNA。RNA或RNA-DNA双链杂合体不能作为模板。,大肠杆菌RNA聚合酶的主要成分与功能,大多数原核生物RNA聚合酶的组成是相同的，大肠杆菌RNA聚合酶由2个亚基、一个亚基、一个亚基和一个亚基组成，称为核心酶。加上一个亚基后则成为聚合酶全酶(holoenzyme)，相对分子质量为4.65l05。,由和亚基组成了聚合酶的催化中心。亚基能与模板DNA、新生RNA链及核苷酸底物相结合。 亚基与核心酶的组装及启动子识别有关，并参与

8、RNA聚合酶和部分调节因子的相互作用。,因子的作用是负责模板链的选择和转录的起始，它使酶专一性识别模板上的启动子。因子可以提高RNA聚合酶对启动子区DNA序列的亲和力，酶底结合常数提高103倍，酶底复合物的半衰期可达数小时甚至数十小时。因子还能使RNA聚合酶与模板DNA上非特异性位点的结合常数降低104倍，使酶底复合物的半衰期小于1s。加入因子，使RNA聚合酶全酶识别启动子序列的特异性总共提高107倍。,E.Coli各识别的启动子的序列,转录的起始从化学过程来看是单个核苷酸与开链启动子酶复合物相结合构成新生RNA的5端，再以磷酸二酯键的形式与第二个核苷酸相结合，起始的终止反映在因子的释放。当新

9、生RNA链达到69个核苷酸时，能形成稳定的酶DNARNA三元复合物，并释放因子，转录进人延伸期。,当聚合酶按5 3方向延伸RNA链时，解旋的DNA区域随之移动。聚合酶可以横跨约40bp，而解旋的DNA区域大约是17bp。自由核苷酸能被聚合酶加到新生的RNA链上，并形成DNA-RNA杂合体。随着聚合酶在模板上的运动，靠近3端的DNA不断解旋，同时在5端重新形成DNA双链，将RNA链挤出DNA-RNA杂合体。RNA的3端大约有2030个核苷酸与DNA和聚合酶相结合。,大肠杆菌RNA聚合酶的组成分析,真核生物中共有3类RNA聚合酶，它们在细胞核中的位置不同，负责转录的基因不同。真核生物RNA聚合酶一

10、般有814个亚基所组成，分子质量超过5105。 不同生物3类聚合酶的亚基种类和大小存在两条普遍原则: 一是聚合酶中有两个相对分子质量超过1105的大亚基； 二是同种生物3类聚合酶有共享小亚基的倾向，即有几个小亚基是其中3类或2类聚合酶所共有的。,真核细胞的三种RNA聚合酶特征比较,真核生物线粒体和叶绿体中还存在着不同的RNA聚合酶： 线粒体RNA聚合酶：相对分子质量小于7x104，是已知最小的RNA聚合酶之一，与T7噬菌体RNA聚合酶有同源性。 叶绿体RNA聚合酶：比较大，结构上与细菌中的聚合酶相似，由多个亚基组成，部分亚基由叶绿体基因组编码。,RNA聚合酶与DNA聚合酶的区别,322 转录复

11、合物,启动子选择阶段包括RNA聚合酶全酶对启动子的识别，聚合酶与启动子可逆性结合形成封闭复合物（closed complex）。伴随着DNA构象上的重大变化，封闭复合物转变成开放复合物(open complex)，聚合酶全酶所结合的DNA序列中有一小段双链被解开。,强启动子从封闭复合物到开放复合物的转变是不可逆的，是快反应。开放复合物与最初的两个NTP相结合并在这两个核苷酸之间形成磷酸二酯键后(RNA聚合酶、DNA和新生RNA)三元复合物。,RNA合成的起始,真核生物转录起始复合物的分子量很大：RNA聚合酶、7种辅助因子，辅助因子又包含多个亚基。,三元复合物可以进入两条不同的反应途径，一是合成

12、并释放29个核苷酸的短RNA转录物流产式起始;二是尽快释放亚基，转录起始复合物通过上游启动子区并生成由核心酶、DNA和新生RNA所组成的转录延伸复合物。,转录的真实性取决：有特异的转录起始位点；转录起始后按照碱基互补原则准确地转录模板DNA序列；具有特异的终止部位。 RNA的合成是在模板DNA的启动子位点上起始的，而这个任务是靠因子来完成的。RNA聚合酶的核心酶虽可合成RNA，但不能找到模板DNA上的起始位点。核心酶的产物不均一，因为它没有固定的起始位点，而且DNA两条链都可作为模板。,只有带因子的全酶才能专一地与DNA上的启动子结合，选择其中一条链作为模板，合成均一的产物。因子的作用只是起始

13、而已，一旦转录开始，它就脱离了起始复合物，而由核心酶负责RNA链的延伸。因此，聚合酶全酶的作用是启动子的选择和转录的起始，而核心酶的作用是链的延伸。,转录延伸复合物是转录循环中一个十分重要的环节。与转录起始复合物相比，延伸复合物极为稳定，可以长时间地与DNA模板相结合而不解离。只有遇到转录终止信号时，RNA聚合酶才停止加入新核苷酸，RNADNA杂合物解离，释放转录产物并导致聚合酶从模板DNA上掉下来。,33 启动子与转录起始,大肠杆菌RNA聚合酶与启动子的相互作用主要包括启动子区的识别、酶与启动子的结合及因子的结合与解离。,331 启动子区的基本结构,启动子：一段位于结构基因5端上游的DNA序

14、列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合并具有转录起始的特异性。 基因的特异性转录取决于酶与启动子能否有效地形成二元复合物，所以，RNA聚合酶如何有效地找到启动子并与之相结合是转录起始过程中首先要解决的问题。,转录的起始是基因表达的关键阶段，而这一阶段的重要问题是RNA聚合酶与启动子的相互作用。启动子的结构影响了它与RNA聚合酶的亲和力，从而影响了基因表达的水平。,转录单元(transcription unit)是一段从启动子开始至终止子(terminator)结束的DNA序列。 RNA聚合酶从转录起点开始沿着模板前进，直到终止子为止，转录出一条RNA链。在细菌中，一个转录单元可以是

15、一个基因，也可以是几个基因。,DNA,启动子,转录起点,终止子,编码链,模板链,1,1,RNA,RNA转录单元示意图,转录起点是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，研究证实通常为一个嘌呤。常把起点前面，即5末端的序列称为上游(upstream)，而把其后面即3末端的序列称为下游(downstream)。在描述碱基的位置时，一般用数字表示，起点为+1，下游方向依次为+2、+3，上游方向依次为-1、-2、-3。,启动子区是RNA聚合酶的结合区，结构直接关系到转录的效率。启动子区有什么结构特点呢? Pribnow设计了一个实验：把RNA聚合酶全酶与模板DNA结合后，用DNaseI水解

16、DNA，然后用酚抽提，沉淀纯化DNA后得到一个被RNA聚合酶保护的DNA片段，约有4144个核苷酸对。,原核生物启动子结构,Pribnow,41-44bp,Pribnow分离了fd噬菌体、T7噬菌体等被酶保护的区域，并进行了序列分析，又有人做了50多个启动子的序列分析后发现，在被保护区内有一个由5个核苷酸组成的共同序列，是RNA聚合酶的紧密结合点，现在称为Pribnow区(Pribnow box)，这个区的中央大约位于起点上游10bp处，所以又称为10区。,从噬菌体的左、右启动子PL及PR和SV40启动子的35bp附近找到了另一段共同序列: TTGACA。分析了46个大肠杆菌启动子序列以后，确

17、证绝大部分启动子都存在这两段共同序列，即位于10bp处的TATA区和35bp处的TTGACA区。 -10位的TATA区和-35位的TGACA区是RNA聚合酶与启动子的结合位点，能与因子相互识别而具有很高的亲和力。,大肠杆菌RNA聚合酶全酶所识别的启动子区,T85T83G81A61C69A52,T89A89T50A65A100,典型启动子的结构,-35 -10 转录起点 TTGACA 16-19bp TATAAT 5-9bp,在真核生物基因中，位于转录起始点上游2530bp处的共同序列TATAAA，也称为TATA区。另外，在起始位点上游-70-78bp处还有另一段共同序列CCAAT，这是与原核生

18、物中-35bp区相对应的序列，称为CAAT区(CAATbox)。,真核生物RNA聚合酶启动子所识别的启动子区,编码链,模板链,1,多种不同的调控原件,TATAAA,YANTYY,30,TATA区,第一位碱基转录,332 启动子区的识别,RNA聚合酶是通过氢键互补的方式识别启动子的。在启动子区DNA双螺旋结构中，腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶上的某些基团是氢键供体，而4种碱基中的某些基团是氢键受体。由于它们分别处于DNA双螺旋的大沟或小沟内，因此都具有特定的方位，而酶分子中也有处于特定空间构象的氢键受体与供体，当它们与启动子中对应的分子在一定距离内互补时，就形成氢键，相互结合。,333 酶与启动子区的结

19、合,在RNA聚合酶与启动子相互作用的过程中，聚合酶首先与启动子区闭合双链DNA相结合，形成二元闭合复合物，然后经过解链得到二元开链复合物。解链区一般在-9+13之间，而酶与启动子结合的主要区域在其上游。,一旦开链区解链，酶分子能以正确的取向与解链后的有关单链相互作用，形成开链复合物。因此，RNA聚合酶既是双链DNA结合蛋白，又是单链DNA结合蛋白。DNA开链是按照DNA模板序列正确引入核苷酸底物的必要条件。,起始 (Initiation) 延伸 (Elongation) 终止 (Termination),RNA polymerase catalyzes transcription:,334 -

20、10区和-35区的最佳间距,在原核生物中，-35区与-10区之间的距离大约是1619bp，小于15bp或大于20bp都会降低启动子的活性。保持启动子这二段序列以及它们之间的距离都是重要的，否则就会改变它所控制基因的表达水平。 增减bp ，-35区相对于-10区旋转（增减1bp会使两者之间夹角发生360的变化）所产生的超螺旋会发生改变。,在细菌中常见两种启动子突变，一种叫下降突变(down mutation)：把Pribnow区从TATAAT变成AATAAT就会大大降低其结构基因的转录水平;另一类突变叫上升突变(up mutation)：增加Pribnow区共同序列的同一性。在乳糖操纵子的启动子

21、中，将其Pribnow区从TATGTT变成TATATT，就会提高启动子效率，提高乳糖操纵子基因的转录水平。,335 增强子及其功能,增强子发现从SV40开始，在SV40转录单元上发现它的转录起始位点约200bp处有两段72bp长的重复序列，不是启动子的一部分，但能增强或促进转录的起始，除去这两段序列会大大降低基因转录水平，保留其中一段或将之取出插至DNA分子的任何部位，就能保持基因正常转录。 能强化转录起始的序列为增强子或强化子(enhancer)。,把-珠蛋白基因置于带有上述72bp序列的DNA分子上，发现它在体内的转录水平提高了200倍。无论把这段72bp序列放在转录起点上游1400bp或

22、下游3300bp处，它都有转录增强作用。增强子通过影响染色质DNA-蛋白质结构并改变超螺旋而改变模板的整体结构，使得RNA聚合酶更容易与模板DNA相结合，起动基因转录。,增强子的特点,1. 远距离效应 10kb能发挥作用 2. 无方向性 可位于靶基因上游、下游或内部 3. 顺式调节 调节位于同一染色体靶基因 4. 无物种和基因的特异性 5. 具有组织特异性 6. 有相位性 7. 有的增强子可以对外部信号产生反应 被固醇类激素激活,绝大多数功能蛋白基因的启动子都具有共同的结构模式。真核基因的启动子在-25-35区含有TATA序列(TATA box) ，在-70-80区含有CCAAT序列(CAAT

23、 box)，在-80-110含有GCCACACCC或GGGCGGG序列(GC box)。TATA区上游的保守序列称为上游启动子元件(upstream promoter element，UPE)或称上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)。,336 真核生物启动子对转录的影响,原核和真核基因转录起始位点上游区结构存在很大差别。 原核基因启动区范围较小，TATAAT (Pribnow区)的中心位于-10，上游只有TTGACA区(-35区)作为RNA聚合酶的主要结合位点，参与转录调控;真核基因的调控区较大，TATA A/TA区位于-20-30，而-40-110

24、区为上游激活区。真核基因除了含有可与原核基因启动子相对应的CAAT区（7078区）之外，大多数基因还拥有GC区和增强子区。,TATA区和其他两个UPE区的作用有所不同。前者的主要作用是使转录精确地起始，如除去TATA区或进行碱基突变，转录产物下降的相对值不如CAAT区或GC区突变后明显，但所获得的RNA产物起始点不固定。,CAAT区和GC区主要控制转录起始频率，基本不参与起始位点的确定。 CAAT区对转录起始频率的影响最大，该区任一碱基的改变都将极大地影响靶基因的转录强度，而启动区其他序列中一两个碱基的置换则没有太大的影响。 在TATA区和相邻的UPE区之间插入核苷酸也会使转录减弱。,3种启动

25、子区序列都有重要功能，但并不是每个基因的启动子区都包含这3种序列。有些基因，如SV40早期基因，缺少TATA和CAAT区，只有6个串联在上游-40-110位点的GC区;有些基因，如组蛋白H2B，不含GC区，但有两个CAAT区，一个TATA区。 真核细胞中存在着大量特异性或组成型表达的、能够与不同基因启动子区UPE相结合的转录调控因子。基因转录实际上是RNA聚合酶、转录调控因子和启动子区各种调控元件相互作用的结果。,337 转录的抑制,抑制剂 靶酶 抑制作用,利福霉素 细菌全酶 和亚基结合，抑制起始,利迪链霉素 细菌核心酶 和亚基结合，抑制起始,放射线素D 真核生物RNA聚合酶 与DNA结合，阻

26、止延伸,鹅膏蕈碱 真核生物RNA聚合酶 与真核生物RNA聚合酶 结合,34 原核生物与真核生物 mRNA的特征比较,mRNA在大肠杆菌细胞内占总RNA的2%左右(tRNA占16%，而rRNA则占80%以上)。科学家猜想生物细胞内存在能将遗传信息从DNA上转移到蛋白质分子上的信使(或称模板)，但由于mRNA在细菌细胞内的半衰期很短，直到20世纪70年代初才首次将这一重要物质从细胞中分离出来。,mRNA在所有细胞内执行着相同的功能，即通过密码三联子翻译生成蛋白质，但其生物合成具体过程和成熟mRNA的结构在原核和真核细胞内是不同的。真核细胞mRNA最大特点在于它以一个较大相对分子质量的前体RNA出现

27、在核内，只有成熟的、相对分子质量明显变小并经化学修饰的mRNA才能进入细胞质参与蛋白质的合成。所以，真核细胞mRNA的合成和功能表达发生在不同的空间和时间范畴内。,原核生物中，mRNA的转录和翻译发生在同一个细胞空间里，这两个过程几乎是同步进行的，蛋白质合成往往在mRNA刚开始转录时就被引发。 一个原核细胞的mRNA(包括病毒)有时可以编码几个多肽，而一个真核细胞的mRNA最多只能编码一个多肽。 原核生物常以AUG作为起始密码子，有时GUG或UUG也作为起始密码子；真核生物几乎都以AUG作为起始密码子。,341 原核生物mRNA的特征,1、原核生物mRNA的半衰期短：细菌基因的转录与翻译是紧密

28、相联的，基因转录一旦开始，核糖体就结合到新生mRNA链的5端，启动蛋白质合成，而此时该mRNA的3端还远远没有转录完全。,绝大多数细菌mRNA的半衰期很短，mRNA的降解紧随着蛋白质翻译过程发生。转录开始1 min后，降解就开始了，当一个mRNA5端开始降解时，其3端部分仍在合成或被翻译。mRNA降解的速度大概是转录或翻译速度的一半。,因为基因转录和多链肽延伸的速度基本相同，所以细胞内某一基因产物(蛋白质)的多少决定于转录和翻译的起始效率，以大肠杆菌色氨酸合成酶基因为例，平均每分钟约有15次转录起始，mRNA链从生成到降解平均被翻译10次，稳定状态下细胞中每分钟生成150个多肽。,2、许多原核

29、生物mRNA以多顺反子的形式存在：细菌mRNA可以同时编码不同的蛋白质。 多顺反子mRNA：编码多个蛋白质的mRNA。多顺反子mRNA是一组相邻基因的转录产物。这一组基因被称为一个操纵子。 单顺反子mRNA：只编码一个蛋白质的mRNA。,所有mRNA都被分成3部分:编码区、位于AUG之前的5端上游非编码区以及位于终止密码子之后不翻译的3端下游非编码区。 编码区始于起始密码子AUG，经一连串编码氨基酸的密码子直至终止密码子。 对于多顺反子mRNA中的第一个顺反子来说，一旦mRNA的5端被合成，翻译起始位点即可与核糖体相结合，而后面几个顺反子翻译的起始就会受其上游顺反子结构的调控。,一种情况是，第

30、一个蛋白质合成终止以后，核糖体分解成大、小亚基，脱离mRNA模板，第二个蛋白的翻译必须等到新的小亚基和大亚基与该蛋白起始密码子相结合后才可能开始。 另一种情况是前一个多肽翻译完成以后，核糖体大、小亚基分离，小亚基不离开mRNA模板，而是迅速与游离的大亚基结合，启动第二个多肽的合成。,在噬菌体RNA中，一个顺反子的翻译有时完全取决于它前面顺反子的翻译，噬菌体RNA往往形成复杂的二级结构，只有第一个翻译起始位点是暴露的，在这个顺反子翻译产生多肽的过程中，核糖体的运动破坏了后续顺反子的二级结构，才使起始位点较容易与核糖体相结合形成起复合物 。,3、原核生物mRNA的5无帽子结构，3 端无或者只有较短

31、的poly(A)结构,起始密码子AUG上游712个核苷酸有SD序列保守区，与16S rRNA3端反向互补，在核糖体mRNA的结合过程起作用。,342 真核生物mRNA的特征,凡是编码功能蛋白的真核基因都通过RNA聚合酶进行转录。 真核基因几乎都是单顺反子，只包含一个蛋白质的信息，其长度在几百到几千个核苷酸之间。 一个完整的基因，不但包括编码区(coding region)，还包括不编码氨基酸的5和3 端的特异性序列。,“基因”的分子生物学定义是:产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列 真核生物mRNA结构上的最大特征是5端的帽子及3的poly A 结构。,1、真核生物mRNA的5 端

32、的帽子,真核生物的mRNA(不包括叶绿体和线粒体)5 端都是经过修饰的，基因转录一般从A起始，第一个核苷酸保留了5端的三磷酸基团并能通过其3-OH位与下一个核苷酸的5 磷酸基团形成二酯键，转录产物的起始序列为: pppApNpNp 体外用核酸酶处理成熟mRNA;其5 端并不产生预期的核苷三磷酸，而产生以5 5 三磷酸基团相连的二核苷酸，5终端是一个在mRNA转录后加上去的甲基化鸟嘌呤 。,帽子覆盖了mRNA的5端，它可在几个位点被甲基化,G,A,A,Guanine-7-methyl-transferase,2-O-methyl-transferase,Cap 0,1015%,100%,mRNA

33、5端加“G”的反应是由鸟苷酸转移酶完成的，这个反应非常迅速，在新生mRNA链达到50个核苷酸之前，帽子结构就已加到mRNA的第一个核苷酸上了。即mRNA几乎一诞生就是戴上帽子的。新加上的G与mRNA链上所有其他核酸苷方向正好相反，像一顶帽子倒扣在mRNA链上。,mRNA的帽子结构常常被甲基化。第一个甲基出现在所有真核细胞的mRNA中，称为零号帽子(cap0)。 第二个核苷酸(原mRNA5第一位)的2-OH位上加另一个甲基。有这个甲基的结构称为1号帽子(cap1)，真核生物中以这类帽子结构为主。 某些生物细胞内，mRNA链上的第三个核苷酸的2-OH位也可能被甲基化，被称为2号帽子（cap2），占

34、有帽mRNA总量的10%15%。,mRNA 5末端帽子特征的生物学功能：,I: 使mRNA免遭核酸酶的破坏，保持其结构的稳定性； II: 利于蛋白质起始因子的识别，从而促进翻译的起始。,2、多数真核生物mRNA有多聚A 尾巴,除组蛋白基因外，真核生物mRNA的3末端都有poly A 序列，其长度因mRNA种类不同而变化，40200个。 Poly A 序列是在转录后加上去的，是在细胞核中的不均一核RNA阶段加上的。,真核基因的3末端poly(A)起始位点上游1530bp处有一段保守序列AAUAAA，这对于初级转录产物的准确切割及加poly(A)是必需的。 点突变实验将AAUAAA的基因序列AAT

35、AAA变为AAGAAA，发现mRNA的剪接加工受阻，没有功能性mRNA产生。,RNA聚合酶是真核细胞核中转录RNA的酶。 RNA聚合酶在poly A 起始位点不终止而继续转录，大部分基因的初级转录产物拥有poly A 位点下游0.52kb核苷酸序列。 加poly A 时需要由内切酶切开mRNA3端的特定部位，然后由poly A 合成酶催化多聚腺苷酸的反应。,3端加尾,多聚腺苷酸尾巴,AAUAAA： 准确切割 加poly（A）,poly(A)是mRNA由细胞核进入细胞质所必需形式，提高mRNA在细胞质中的稳定性。mRNA刚从细胞核细进入胞质时，其poly(A)较长，随着mRNA在细胞质内逗留时间

36、延长，poly(A)逐渐变短消失，mRNA开始降解。 真核生物mRNA大都具有poly(A)尾巴，这一特性已被广泛应用于分子克隆。常用寡聚dT片段与mRNA上的poly(A)相配对，作为反转录酶合成第一条cDNA链的引物。,PolyA用来从总RNA中分离mRNA,可设计寡聚Oligo (dT)片段合成cDNA,mRNA: 5 NNNN.NNNNNNAAAAA 3 TTTTT 5,cDNA: 3 NNNN.NNNNNNTTTTT 5,大部分真核mRNA有poly(A)尾巴，细胞中还有1/3没有poly(A)的mRNA，带有poly(A)的mRNA称为poly(A)+，而把没有poly(A)的mR

37、NA称为poly(A)。约1/3的poly(A)mRNA编码了不同形式的组蛋白，其余2/3的poly(A)mRNA带有与poly(A)+组分相同的遗传信息。,原核生物和真核生物mRNA结构的比较,35 终止和反终止,RNA聚合酶启始基因转录后，它就会沿着模板53方向不停地移动，合成RNA链，直到碰上终止信号时才与模板DNA相脱离并释放新生RNA链。终止发生时，所有参与形成RNA-DNA杂合体的氢键都必须被破坏，模板DNA链才能与有意义链重新组合成DNA双链。,351 由基因序列决定的终止,终止位点上游存在富含GC碱基二重对称区，由这段DNA转录产生的RNA形成发卡式结构。终止位点前有一段由48

38、个A组成的序列，所以转录产物的3端为寡聚U，这种结构特征决定了转录的终止。 RNA中出现发卡式结构会导致RNA聚合酶暂停，破坏RNA-DNA杂合链5端正常结构。寡聚U存在使杂合链3端部分出现不稳定rUdA区域。两者共同作用使RNA从三元复合物中解离出来。,发夹式结构和寡聚U的共同作用使RNA从三元复合物中解离出来。,终止效率与二重对称序列和寡聚U的长短有关，长度 效率,352 依赖于因子的终止,因子是分子质量为2.0 xl05的六聚体蛋白，它是NTP酶，它通过催化NTP的水解促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。依赖于因子的转录终止区DNA序列无共性，因子不能识别这些终止位

39、点。,RNA合成起始以后，因子即附着在新生的RNA链上，靠ATP水解产生的能量，沿着53方向朝RNA聚合酶移动，到达RNA的3-OH端后取代了暂停在终止位点上的RNA聚合酶，使之从模板DNA上释放出来，同时释放mRNA，完成转录过程。,结合上来追赶RNApol,追赶上来（暂停）,与RNApol相互作用使杂交链解链,353 RNA合成的抗终止,(1) 抗终止的定义 RNA聚合酶越过一个或多个终止子实现通读。 (2) 抗终止的两种作用方式 抗终止蛋白作用于RNA聚合酶。 破坏终止点RNA的茎-环结构，即破坏mRNA终止子特定的二级结构。,Termination of transcription c

40、an be regulated,抗终止作用决定RNA聚合酶在终止子位点处终止还是读下去,Antitermination extends the transcription unit,抗终止蛋白可作用在RNA聚合酶上，使之越过特定终止子而通读,36 内含子的剪接、编辑及化学修饰,361 RNA中的内含子 真核基因表达往往伴随着RNA的剪接过程,从mRNA前体分子中切除被称为内含子(intron)的非编码区，并使基因中被称为外显子(exon)的编码区拼接形成成熟mRNA。 真核基因大多是断裂的，即一个基因可由多个内含子和外显子间隔排列而成。内含子在真核基因中所占的比例很高，可超过99%。,用DNA

41、-RNA杂交的方法验证鸡卵清蛋白基因中存在非编码的内含子区。a. 成熟mRNA与带有该基因的互补链DNA序列杂交示意图；b. 鸡卵清蛋白的基因结构示意图,部分人类基因中内含子序列所占的比重分析,由DNA转录生成的原始转录产物核不均一RNA(hnRNA，heterogeneous nuclear RNA)，经过5加“帽”和3酶切加多聚腺苷酸，再经过RNA的剪接，编码蛋白质的外显子部分就连接成为一个连续的可读框(open reading frame，ORF)，通过核孔进入细胞质，作为蛋白质合成的模板。,RNA加工过程及其生理功能,真核基因平均含有8个内含子，前体分子一般比成熟mRNA大410倍。

42、不同生物细胞内含子的边界处存在相似的核苷酸序列。GU-AG和AU-AC分别是不同内含子的5和3边界序列， GU-AG 是主要的， AU-AC 是次要的。除了边界序列之外，外显子与内含子交界处的序列以及内含子内部的部分序列都有可能参与内含子的剪接。,生物体内的各种内含子,脊椎动物前体mRNA中常见内含子剪接所必需的保守序列,362 RNA的剪接,许多相对分子质量较小(106185bp)的核内RNA(如Ul，U2，U4，U5和U6)以及与这些RNA相结合的核蛋白(被称为snRNPs，ribonucleo protein particle)参与RNA的剪接。,mRNA链上每个内含子的5和3端分别与不

43、同的snRNP相结合，形成RNA和RNP复合物。由U1 snoRNA以碱基互补的方式识别mRNA前体5剪接点，由结合在3剪接点上游富嘧啶区的U2AF(U2 auxiliary factor)识别3剪接点并引导U2 snRNP与分支点相结合，形成剪接前体(Pre-spliceosome)，并进一步与U4、U5、U6 snRNP三聚体相结合，形成60 S的剪接体(spliceosome)，进行RNA前体分子的剪接。,哺乳动物细胞中，mRNA前体上的snRNP是从5向下游“扫描”，选择在分支点富嘧啶区3下游的第一个AG作为剪接的3受点。 AG前一位核苷酸可以影响剪接效率，一般说来，CAGUAGAAG

44、GAG。如果mRNA前体上同时存在几个AG，可能发生剪接竞争。,变位剪接,SXL,SXL蛋白合成,没有SXL蛋白的合成,2,3,4,2,4,2,3,4,sxl前体mRNA,图（3-19-a）果蝇中与性别分化相关基因产物的特异性剪接过程,SXL,TRA,无TRA蛋白合成,有TRA蛋白合成,Part of,U2AF65,U2AF65,tra前体mRNA,1,2,1,1,1,1,2,2,2,2,图（3-19-b）果蝇中与性别分化相关基因产物的特异性剪接过程,图（3-19-c）果蝇中与性别分化相关基因产物的特异性剪接过程,I、类内含子的RNA本身具有催化活性，能进行内含子自我剪接。在I类内含子切除体系

45、中，鸟苷或鸟苷酸的3-OH作为亲核基团攻击内含子5端的磷酸二酯键，从上游切开RNA链。再由上游外显子自由3-OH作为亲核基团攻击内含子3位核苷酸上的磷酸二酯键，使内含子被完全切开，上下游两个外显子通过新的磷酸二酯键相连。,UpA,GpU,5 外显子,3 外显子,5 ,3 ,pG-OH,U-OH,GpU,pGpA,RNA剪接中间产物,3 ,5 ,UpU,5 pGpA,G-OH 3 ,5 ,3 ,内含子,自由鸟苷酸的3OH作为亲核 基团攻击内含子5端的磷酸二酯 键，从上游切开RNA链。,上游外显子的自由3OH作为亲 核基团攻击内含子3位核酸上的磷 酸二酯键，使内含子被完全切开。,图（3-20）类内含子的自我剪接过程,在类内含子切除体系中，内含子本身的某个腺苷酸2-OH作为亲核基团攻击内含子5端磷酸二酯键，从上游切开RNA链后形成套索状