《生物化学》教学课件：第16章 DNA的合成及重组 (2)

1、本学期后五次单元测试安排,5月21日 DNA生物合成，RNA生物合成 6月9日 蛋白质合成，基因表达调控 6月24日 第四篇授课内容,5月26日 第一篇第二次测试 6月16日 第二篇第二次测试,均为是非题，每篇50个题目，时间20分钟,21:30-21:50,每次45个题目，时间30分钟，21:30-22:00,DNA的合成及重组 DNA Biosynthesis and Recombination,第十六章,DNA生物合成,校正复制中可能出现的错误，并修复受到损伤的DNA,细胞中酶促修复系统,自然界DNA重组和基因转移的基本方式,基因组复制的主要特点 The General features

2、 of Genome Replication,第一节,一、基因组是细胞或病毒全部遗传信息的总和,含有一种生物的一整套遗传信息的遗传物质，称为基因组（genome）。在真核生物体中，基因组是指一套完整单倍体DNA（染色体DNA）和线粒体DNA的全部序列，既包括编码序列，也包括非编码序列。,二、基因组DNA复制具备一些共同特征,基因组DNA都具有固定的复制起始点 复制过程中形成复制泡和复制叉 复制的基本单位称为复制子 半保留复制方式保证遗传信息的忠实传递 半不连续复制克服了DNA空间结构对DNA 新链合 成的制约 复制起点由多个短重复序列组成 DNA复制必须有引物,复制起点（origin）：指DN

3、A复制所必需的一段特殊的DNA序列。,基因组DNA都具有固定的复制起始点,双螺旋DNA复制时，复制区生长点的结构呈Y形或叉形，称之为复制叉。,复制过程中形成复制泡和复制叉,目 录,从一个DNA复制起点起始的DNA复制区域，它是一个独立复制单位，包括复制起点和终点。,复制子（replicon）,复制的基本单位称为复制子,半保留复制方式保证遗传信息的忠实传递,（1）全保留式（conservative），即恢复原来的DNA双螺旋，并产生一个新的子代DNA双螺旋； （2）半保留式（semiconservative），即新老搭配，由一条新合成的DNA链和一条复制模板链配对产生子代双螺旋DNA； （3）散

4、布式（dispersive），即复制模板链被分成许多小片段，散布于子代DNA中。,两条新合成的DNA链和两条原来的复制模板链之间的结合方式可能性：,密度梯度实验,实验结果支持半保留复制方式,含重氮-DNA的细菌,第一代,第二代,梯度离心结果,前导链（leading strand）: DNA复制时，一条链的合成方向和复制叉前进方向相同，可以连续复制合成的新链。 后随链（lagging strand）:另一条链的合成方向与复制叉前进方向相反，不能连续复制，只能分成若干小片段分别合成，然后连接起来形成新链。后随链中的小片段称为冈崎片段（Okazaki fragments)。,半不连续复制克服了DNA

5、空间结构 对DNA新链合成的制约,前导链连续复制而后随链不连续复制，即DNA半不连续复制。,复制起点的一般特征: 由多个独特的短重复序列组成。 短重复序列被多亚基的复制起始因子所识别并结合。 一般富含AT，利于双螺旋DNA解旋，以产生单链DNA复制模板。,复制起点由多个短重复序列组成,E.coli 复制起始点 oriC,酵母复制起点为自主复制序列（autonomously replicating sequences，ARS）：,酵母染色体含有多个复制起点。,元件A(富含A/T的共有序列)：结合一个特异的蛋白质复合物复制起点识别复合物(ORC)。 3个序列(B1、B2和B3)可以增加复制起点的效

6、率，其中B2的9个碱基与上述ARS共有序列相同。,酵母复制起始点,DNA聚合酶不能从游离的核苷酸开始合成DNA链，必须由引物（primer）提供自由的3-OH末端，通过加入核苷酸使之不断延伸。 所有细胞和多数病毒的DNA复制，首先利用模板合成一段RNA引物，这一过程为引发（priming）。 RNA引物5端的第一个核苷酸通常是pppA（个别为pppG）。,DNA复制必须有引物,1.多数DNA复制使用RNA引物,174等噬菌体以双链环形DNA的一条链上产生切口处的3-OH为引物； 腺病毒及某些线性DNA病毒以结合于病毒DNA的5端磷酸基团的末端蛋白上的dCTP的3-OH为引物开始复制。,2.个别

7、DNA复制以DNA或核苷酸为引物,不同基因组DNA通过不同的模式进行复制,真核生物基因组DNA复制过程涉及反转录 基因组单链DNA通过复制中间体完成复制 有的基因组DNA通过RNA中间体进行复制 双链环状DNA也有不同的复制方式,不同基因组RNA通过不同的模式进行复制,基因组双链RNA复制过程是双链复制 基因组单链正链RNA以负链为模板进行复制 基因组单链负链RNA以正链RNA为模板进行复制 反转录病毒的基因组RNA通过DNA中间体进行复制,DNA复制过程 Process of DNA Replication,第二节,E.coli上有一个固定的复制起始点, 在第82等分位点上, 称为oriC。

8、 oriC 跨度为245bp, 含3组串联重复序列(Tandem array)和2组反向重复序列。串联序列为识别区，反向序列富含AT，容易解链。,有固定的复制起始点吗？,一、原核生物DNA复制体现了复制的基本过程和特征,（一）在复制起点解旋酶和多种因子形成复合物 1. E.coli复制起始需要6种蛋白质因子,DnaA、DnaB、DnaC、HU、 促旋酶（gyrase，即拓扑异构酶）、 单链DNA结合蛋白(single strand binding protein, SSB),2. 解螺旋酶激活引发酶形成,3. 解旋还需要促旋酶和SSB,E.coli DNA复制起始,结合oriC的4个9bp反向

9、重复序列形成复制起始复合物。,DnaA蛋白,作用于oriC的3个13bp正向重复序列，DNA在这3个位点解链，形成开放型复合物（open complex）。,53解旋酶作用产生两条复制模板链 激活引发酶DnaG蛋白 DnaB蛋白与引发酶结合，形成引发体,DnaB蛋白,使一条DNA链围绕着另一条旋转，消除解旋产生的张力。,促旋酶,SSB蛋白,HU蛋白,稳定解旋后的单链DNA构象，有助于解旋。,DNA结合蛋白，对复制起促进作用。 HU蛋白能够使DNA发生折叠。,E.coli 中DnaB结合引发酶DnaG，催化合成RNA引物，其序列始于pppAG，模板链序列3-GTC-5，引物长度一般1112个碱基

10、。,（二）引发酶合成RNA引物,负责切除RNA引物。,（三）复制时聚合酶催化DNA合成而 聚合酶切除引物,DNA聚合酶,可利用损伤尚未修复的DNA链作为模板合成DNA，但不能修复损伤。,负责合成DNA。,DNA聚合酶,DNA聚合酶,亚基（130 000）主要功能是合成DNA 亚基具有35外切酶活性（校正功能）亚基可增强其活性 亚基可能起组装作用,核心酶由、和亚基组成：,DNA聚合酶全酶结构,2个-亚基分别和1个核心酶相互作用，其柔性连接区可以确保在复制叉1个全酶分子的2个核心酶能够相对独立运动，分别负责合成前导链和后随链。,功能：-复合物是DNA夹子加载蛋白，负责将可沿DNA链滑动的一对-亚基

11、（DNA夹子）加载于DNA，使DNA聚合酶具有持续合成能力。,-复合物由6种亚基组成：、,个核心酶 1个-复合物（、 6种亚基） 可滑动的DNA夹子（含1对-亚基）,DNA聚合酶全酶结构,全酶结构包括：,（二） 复制的延长,1、聚合子代DNA： 由DNA聚合酶催化，以35方向的亲代DNA链为模板，从53方向聚合子代DNA链。在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶；而在真核生物中，是DNA聚合酶(延长随从链)和（延长领头链）。,2、引发体移动： 引发体向前移动，解开新的局部双螺旋，形成新的复制叉，随从链重新合成RNA引物，继续进行链的延长。,（三）复制的终止,1、去除引物，填补缺口：

12、在原核生物中，由DNA聚合酶来水解去除RNA引物，并由该酶催化延长引物缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。而在真核生物中，RNA引物的去除，由一种特殊的核酸酶来水解，而冈崎片段仍由DNA聚合酶来延长。,53外切酶：去除RNA引物 35外切酶：起校正作用 DNA聚合酶活性：填补两个冈崎片段之间的缺口,DNA聚合酶有3个酶促活性结构域:,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段：Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol ,2、连接冈崎片段： 在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完

13、整的DNA长链。,Tus蛋白具有反解旋酶（contra-helicase）活性，识别并结合ter序列中共有序列，阻止Dna B蛋白的解旋作用，从而抑制复制叉前进。 Tus蛋白除了使复制叉停止运动以外，还可能造成复制体解体。,(四) Tus蛋白识别复制终点使复制终止,在复制叉汇合点两侧约100kb处各有一个终止区（ter D/A和ter C/B）。,当oriC处于半甲基化状态时，SeqA蛋白迅速结合半甲基化的GATC，阻止Dam甲基化酶与之结合，使复制起点不能被完全甲基化，同时阻止DnaA蛋白结合oriC。 oriC的GATC被完全甲基化，DnaA蛋白就能与之结合，开始新的一轮复制。,(五) D

14、NA甲基化保证复制起点在每个复制周期中仅起一次作用,E.coli复制起点oriC含有11个拷贝GATC，这一回文序列中的A是Dam甲基化酶的靶位点。,在复制过程中，DNA每复制10bp，复制叉前方的模板DNA双螺旋就要绕其长轴旋转一周，产生正超螺旋。 拓扑异构酶是一种可逆的核酸酶。它们可共价结合DNA分子上的磷酸基团，切断磷酸二酯键。,(六) DNA复制需要两类DNA拓扑异构酶,消除正超螺旋，使复制叉能够顺利前进。 维持E.coli、噬菌体和质粒DNA复制起始模板DNA负超螺旋状态。 环形染色体复制后产生的两个子染色体连环体解连环。,DNA拓扑异构酶功能：,E.coIi的Topo只作用于负超螺

15、旋DNA，消除负超螺旋。,DNA拓扑异构酶的功能：,E.coli的Topo将前方产生的正超螺旋转变为负超螺旋。,DNA拓扑异构酶的功能,E.coli 的Topo功能是将复制产生的两个子染色体从连环体中分离出来，催化连环和去连环过程 。,二、真核生物DNA复制,哺乳动物的细胞周期,DNA合成期, 细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。,Nurse, Hartwell and Hunt discovered two proteins, cyclin and CDK (cyclin depe

16、ndent kinase), that control the transition from one stage to another. These proteins are called checkpoints.,Sir Paul Nurse,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制起始点比E.coli的ori C短。酵母DNA复制起始点含11bp富含AT的核心序列：A(T)TTTATA(G)TTTA(T), 称为自主复制序列(ARS, autonomous replication sequences) 。,（一）复制的起始,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制

17、有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。,复制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)。,增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。,真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等； DNA复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合酶/转换； 切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶RNAse H和FEN1等。,真核生物与原核生物DNA复制的差异：,Pol 负责合成引物 Pol 负责DNA复制、核苷酸切除修复和碱基切除

18、修复 Pol 的功能与Pol 相似（其确切功能尚待定） Pol 可能和碱基切除修复有关 Pol 负责线粒体DNA复制和损伤修复,常见的真核DNA聚合酶有5种：,真核DNA复制叉主要蛋白质的功能,(二)真核DNA复制叉主要蛋白质的类型和功能与原核基本相似,DNA聚合酶（Pol ）分子含有4个亚基：,1. DNA聚合酶/引发酶复合物 合成RNA-DNA引物,p180：催化亚基 p48：具有引发酶活性 p58：p48的稳定性和活性所必需的 p70：与组装引发体有关,功能：合成RNA引物 反应过程： 调节：磷酸化的调节作用,Pol /引发酶复合物,首先，合成RNA引物； 其次，利用DNA聚合酶活性将引物延伸，产生起始DNA（initiator DNA，iDNA）短序列，形成RNA-DNA引物； 最后，Pol /引发酶脱离模板链DNA，发生DNA聚合酶转换（switch）。,结构： p70、p34和p11组成异源三聚体 功能：,2. RPA的功能与E.coli的SSB相似,复制蛋白A（replication protein A，RPA）,结合单链DNA 促使双螺旋DNA解旋 激活Pol /引发酶活性 为Pol 依赖复制因子C（RFC）和增殖细胞核抗原（PCNA）合成DNA所必需 RPA三聚体与SV40 T抗原结合，组装引