革兰氏染色及油镜的使用.ppt

1、,一 目的要求： 1、学习并初步掌握革兰氏染色法。 2、了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类 鉴定中的重要性。 3、掌握油镜原理及使用方法。,二 基本原理： 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gran 创立的，基本步骤是： 1、初染：结晶紫染色 2、媒染：碘液媒染 3、脱色：乙醇脱色 4、复染：番红复染,实验一 革兰氏染色及油镜的使用,经此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染上复染剂的颜色（红色）的细菌为革兰氏阴性菌。,Gram stain of Gram -,Gram stain of Gram +,细菌对革兰氏染色的不同反

2、应是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。初染后，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫碘的复合物，增强染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔经缩小，透性降低，从而使结晶紫碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂质含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。,油镜原理及说

3、明 微生物是个体微小、结构简单、肉眼无法看到的微小生命体。因此，我们要借助显微镜来进行观察。显微镜的种类很多，但基本构造可分为两大部分 ：一是机械装置，二是光学系统。（下面以普通光学显微镜为例）。,1、机械装置由镜座、镜臂、镜筒与物镜转移器、载物台、移动器粗细调节器组成。 2光学系统由目镜、物镜、聚光镜、反光镜、光圈组成。 （1）目镜：装在镜筒的上端，一般各有8x、 10 x、15x、16x等种不同的放大倍数的目镜。目镜只能把物镜成的像再次放大，没有辨析能力。 （2）物镜：显微镜的物镜是由一组特殊的透镜组成。一般有低倍镜（ 10 x ）、高倍镜（ 40 x ）和油镜（ 100 x ），它们各有

4、一定的放大率，不仅可以放大标本，而且有辨析能力。,低倍镜：它的视野的实际范围最大，易于发现目标，但不易看清微生物个体的形态。 高倍镜：高倍镜视野的实际范围较低倍镜小些。可以看清个体较大的微生物个体或菌丝体形态，但个体较小的微生物以及其内含物和特殊结构也无法辨清。 油镜：一般在镜头上有黑圈或红圈表示的为油镜物镜，也有的以“Oil”字样表示，油镜的镜面很小，工作距离很近。使用时，在载玻片和油镜物镜之间加上一滴油（常用香柏油）（而使用低倍、高倍镜时，是隔以空气）。当光线通过载玻片时，由于玻璃与香柏油的折射率相近，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，这样就可以增加照明度，是镜检物清晰（参见表1）。,

5、表1 光线通过几种介质的折射率（n）比较：,三、器材： 大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，革兰氏染色液， 载玻片，显微镜等 四、操作步骤： 1、涂片：将大肠杆菌（24h）和金黄色葡萄球菌 （24h）分别涂片、干燥、固定。 2、染色： （1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗 （2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖一分钟，水洗 （3）脱色：将水甩净，并衬以白背景，用95%乙醇滴洗至刚刚无紫色为止，约2030秒，立即用水冲净乙醇 （4）复染：用番红液染1-2分钟，水洗,3、镜检：干燥后，油镜观察。以分散开的细菌颜色为准，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 4、混合制片观察：一载玻片上两种菌混合制片，对比观察。,五、实验报告： 1、结果：列表简述2株细菌的染色观察结果（形状、颜色、革兰氏染色反应）。 2、思考题： 1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键步骤是什么？ 2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，