第五讲1 中药含量测定方法

1、第五讲1 中药含量测定方法（Determination of Traditional Chinese Medicine）含量测定的定义和意义 中药制剂的含量测定是指用适当的化学方法或仪器分析方法对制剂中某种（些）有效成分或有效部位进行的定量分析。并以其测定结果是否符合药品标准的规定来判断药品的优劣，是控制和评价药品质量的重要方法。 含量测定方法 中药制剂含量测定的方法包括化学分析法和仪器分析法两大类。由于中药制剂组成复杂，仪器分析法更为常用。中国药典中药制剂含量测定方法概况见下表。 本章重点介绍TLCS、HPLC、GC、HPCE、挥发油测定法、分光光度法、浸出物测定法、容量分析、重量分析。一、

2、薄层色谱法实验仪器CAMAG Linomat 5 半自动点样仪 CAMAG Scanner3 薄层色谱扫描仪CAMAG 数码摄像系统甘草（Licorice ) 种类：乌拉尔甘草（Glycyrrhiza ura.Fis.） 胀果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat.） 光果甘草 (Glycyrrhiza glabra L.) 药效:补脾益气、解毒保肝、润肺止咳、调和诸药。 化学成分:皂苷类（甘草酸）、黄酮类（甘草苷）、香豆素类、氨基酸和多糖类化合物。甘草的硅胶薄层扫描指纹图谱(SG-TLCS-FP), fingerprintTLCS-3D-FP在监控药材质量方面的应用聚酰胺薄层指

3、纹图谱（PA-TLCS-FP)甘草聚酰胺薄层扫描图谱1、概述 （1）薄层色谱法的特点 设备简单，操作方便。 广泛地选用各流动相，比气相色谱灵活。 灵敏度较高 薄层色谱法适于分析小量样品 可以采用多种展开方式：如，双向展开，多次展开，分步展开，连续展开；分离原理是的物理化学原理，例如，吸附色谱，分配色谱，离子交换，薄层电泳，薄层等电聚焦。适于分析热不稳定，难挥发的样品。（2）方法原理原理：薄层色谱分离法是将固定相吸附剂均匀地涂在玻璃上制成薄层板，试样中的各组分在固定相和作为展开剂的流动相之间不断地发生溶解、吸附、再溶解、再吸附的分配过程。 不同物质上升的距离不一样而形成相互分开的斑点从而达到分离

4、。（3）固定相 硅胶：微酸性极性固定相，适用于酸性、中性物质分离（可以制备成酸度不同或碱性硅胶扩大使用范围） 氧化铝：碱性极性固定相，适用于碱性、中性物质分离（可以制备成中性或酸性氧化铝扩大使用范围） 聚酰胺：含有酰胺基极性固定相，适用于酚类、醇类化合物的分离 纤维素：含有羟基的极性固定相，适用于分离亲水性物质2、方法一：薄层色谱-可见分光光度法 1）点样：条状，50300ul 2）定位：对照的位置，区带的范围 紫外、荧光、碘蒸气、对照品定位、紫外扫描 3）捕集： 4）洗脱：类似 柱色谱 渗漉、多次浸出、加热温浸、索氏回流提取 荧光板应洗脱后再比色 5）显色及比色 显色剂用量 反应时间、反应温

5、度 显色稳定性 空白试剂及固定相最好不显色 Off-line3、方法二：薄层色谱-紫外分光光度法 不需加显色剂 其他同薄层色谱-可见分光光度法Off-line4、薄层色谱扫描法 （Thin Layer Chromatography Scan,TLCS）Off-line 1）定义 薄层扫描法（TLCS）系指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中有紫外或可见吸收的斑点或经照射能激发产生荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分值用于药品定性定量分析的方法。 2）特点 具有分离分析双重功能。与高效液相色谱法比较，具有多通道效应，可同时平行分离分析多个样品；流动相用量少且选择范围宽、更换方便；固定

6、相为一次性使用，对样品的预处理要求不高等优点。在中药及其制剂检验中，是重要的分析方法。 中国药典中有32个中成药品种采用该法进行含量测定。 3）仪器及其工作原理1.薄层扫描仪 中国药典采用双波长薄层扫描仪.常用的有岛津CS-930型和CAMAG-型等。2.扫描仪工作原理4）测定方式（1）吸收法 适用于有紫外（可见）吸收的成分，较常用。该法又可采用反射法或透射法测定。理论上讲，透射法比反射法优越，但实际工作中常用反射法，因为紫外光不能通过玻板。 （2）荧光法 适用于有荧光性质的成分，例如小檗碱等。该法仅采用反射法测定，其灵敏度 比吸收法高。 5）测定波长 （1）单波长 一般用于荧光测定法，即用某

7、一波长的紫外光（激发光）进行扫描。对玻板和斑点的质量要求较高。 （2）双波长 主要用于吸收测定法。该法可消除背景干扰，对玻板和斑点的质量要求不高，故较常用。测定时，样品波长（s）和参比波长（R）依次扫描斑点，所测吸收度为A=A(s)A(R)。样品波长（s）：即被测成分的max 参比波长（R）：即被测成分的min或此波长处无吸收。6）光束扫描方式（1）直线扫描 适用于规则的斑点，仅用于荧光测定法。 （2）锯齿扫描 适用于不规则的斑点，测量误差小，被测成分积分值重现性好，故吸收测定法常用此扫描方式。7)光源 （1）钨灯（W）：供可见光（350800nm）测定，扫描有色成分的斑点。 （2）氘灯（D2

8、）：供紫外光（200400nm）测定，扫描有紫外吸收成分的斑点。 （3）氙灯（Xe）：供荧光测定，发射不连续光谱，常用波长为365nm。8)含量测定方法（外标法）TLCS含量测定有外标法和内标法，中国药典仅采用外标法。 a)原理 外标法系将一定量的供试品溶液和对照品溶液分别点加在同一块薄层板上，展开，显色，定位，扫描被测成分和对照品斑点，测得相应的吸收度或荧光强度积分值，根据定量关系，计算出被测成分的含量。 b)类型 根据对照品标准曲线性质的不同，外标法又分为外标一点法和外标两点法。 若标准曲线通过原点，采用外标一点法。 若标准曲线不通过原点，采用外标两点法。 外标一点法的直线方程：C = F

9、 A F为斜率 外标两点法的直线方程：C=F1A + F2 F1为斜率，F2为截距F1=(C2 C1)/(A2 - A1) F2=(A2C1 A1C2)/(A2 A1) 【说明】在根据药品标准测定样品时，并不需要做标准曲线，按照药品标准规定执行即可。当然，测试者应能从中明确该测定是外标一点法还是外标两点法。 c)操作步骤 （1）对照品溶液的制备 （2）供试品溶液的制备 （3）点样 一般要求使用市售薄层板。 外标一点法：至少6个原点 对照品（R）2个（同一质量）：2R 供试品（S）4个（同一质量）分2组：2S1 2S2外标两点法：至少8个原点 对照品（R）4个 分2组：大质量的2个：2R1；小质

10、量的2个：2R2 供试品（S）4个（同一质量）分2组：2S1 2S2 对照品与供试品应交叉点加在同一块薄层板上，目的在于消除各种误差。测定时应保证供试品原点的量在线性范围内，必要时可适当调整供试品溶液的点样量。外标一点法 外标两点法（4）展开 （5）显色定位 供试品色谱中待测斑点的比移值（Rf值）和光谱扫描得到的吸收光谱最大吸收与最小吸收应与对照品相符，以保证测定结果的准确性。 （6）扫描 应沿展开方向扫描，不得横向扫描。 （7）含量计算 外标一点法 求出供试品被测成分（斑点）的质量Ms = MRAs/ AR Ms被测成分的质量（M拔 n=2） MR被测对照品的质量 As被测成分吸收度（荧光强

11、度）积分值（A拔 n=2） AR被测对照品吸收度（荧光强度）积分值（A拔 n=2）求出供试品中被测成分的含量含量（W/W）= Ms 稀释倍数 / 取样量 含量（W/片）= Ms 稀释倍数 平均片重 / 取样量 外标两点法 求出供试品斑点中被测成分的质量Ms = (V2-V1) (A-A1) /(A2-A1) C + V1CMs 被测成分的质量（mg拔 n=2） A1 对照品小点样量吸收度（荧光强度） V1 对照品小点样量（1） 积分值（A拔 n=2 ） V2 对照品大点样量（1） A2对照品大点样量吸收度（荧光强度）A 被测成分吸收度（荧光强度） 积分值（A拔 n=2） 积分值（A拔 n=2）

12、 C 对照液的浓度（mg/ml） 9)应用实例 1.九分散中士的宁的含量测定 九分散是由马钱子粉、麻黄、乳香和没药等制成。马钱子粉中含有士的宁、番木鳖碱等生物碱，具生理活性但也有毒性，故需控制马钱子含量。中国药典规定按干燥品计每包含马钱子以士的宁计应为4.55.5mg。 供试品溶液的制备 取本品10包，混合研匀。精密称取2g置具塞锥形瓶中，精密加氯仿20ml与浓氨试液1ml，轻轻摇匀，称重，于室温下放置24小时，再称重，补足氯仿减失的重量，充分振摇，滤过。精密量取滤液10ml，用硫酸溶液（3300）分次提取，至生物碱提尽，合并硫酸液，置另一分液漏斗中，加浓氨试液使呈碱性，用氯仿分次提取，合并氯

13、仿液，蒸干，放冷，残渣中精密加氯仿5ml使溶解，作为供试品溶液。对照品溶液的制备 取士的宁对照品，加氯仿制成每1ml含0.4mg的溶液，作为对照品溶液。 测定法 吸取上述两种溶液各5l，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯-丙酮-乙醇-浓氨试液（161214）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。照薄层色谱法进行扫描，波长：s=254nm，R=325nm，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，即得。已知：AR19663.07，As20617.25，取样量2.098g。解答问题：采用外标一点法还是外标两点法？采用什么方法显色定位？计算每包药品中马钱子的含量。（保留两位有效数字）

14、求出供试品斑点中士的宁的质量 Ms = MR As/AR = 5l 0.4 g/ l 20617.25/19663.07 = 2.1g求出供试品中士的宁的含量含量（mg/包）= Ms 稀释倍数 标示重量 / 取样量= (0.0021mg 5ml 20ml 2.5g/包) /(0.005ml 10ml 2.098g )= 5.0（mg/包）2.枳实导滞丸中橙皮苷的含量测定本品系由枳实、大黄和黄连等八味药材制成的水丸。中国药典规定按干燥品计算，每1g含枳实以橙皮苷（C28H34O15）计，不得少于20.0mg。供试品溶液的制备 取本品粉末（过三号筛）约0.5g，精密称定（0.5124g），置索氏提

15、取器中，加甲醇90ml，加热回流4小时，趁热滤过至100ml量瓶中，用少量甲醇洗涤容器，洗液与滤液合并，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取5ml，置250ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。对照品溶液的制备 精密称取橙皮苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.05mg的溶液，作为对照品溶液。测定法 精密吸取供试品溶液5l、对照品溶液2l与5l，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲醇为展开剂，展开，展距约3cm，取出，晾干，喷以1三氯化铝的甲醇溶液，放置3小时，在紫外光灯(365nm)下定位。上机进行荧光扫描，激发波长：330nm ，线性扫描，测量供试品与对照品荧光强度的积分值AR(2l) =

16、885.7 AR (5l) = 979.4 As = 835.6，计算，即得。说明：聚酰胺TLC分离黄酮类成分效果较好故选之。 橙皮苷与AlCl3反应显色，在330nm紫外光下发射较强的绿色荧光（波长:500nm）。回答问题：本法采用的是吸收测定法还是荧光测定法？外标一点法还是外标两点法？透射法还是反射法？直线扫描还是锯齿扫描？光源是什么？ 求算枳实（橙皮苷）的含量（保留三位有效数字），并判断是否符合药典规定 含量计算求算出斑点中橙皮苷的质量Ms = (V2-V1) (A-A1) /(A2-A1) C + V1C=代入数据= 0.0198g.求算出枳实（橙皮苷）在药品中的含量含量（mg/g）=

17、 Ms 稀释倍数 / 取样量=代入数据= 38.6薄层扫描法测定荷叶中荷叶碱的含量CAMAG TLC SCANNER 3薄层扫描仪(瑞士CAMAG公司)；定量点样毛细管(美国Drummond Scientific Co.)；荷叶碱(中国药品生物制品检定所)；硅胶GF254 (青岛海洋化工有限公司) 薄层板：0.5 %氢氧化钠溶液制备的硅胶GF254薄层板。 展开剂：氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水(30402010)10以下放置12 h的下层溶液。 s = 272 nm。单波长线性扫描。二、高效液相色谱在经典液相柱色谱法基础上发展起来的一种色谱方法 液相柱色谱法原理和气相色谱理论相结合的产物 当今色谱

18、技术中极具活力、发展迅速的分离分析技术 技术难度较大、不宜熟练掌握、极具 挑战性的分离分析方法 达到基线分离的分离度 Rs：1.5一般分析要求的分离度 Rs 1.25分离度与实际分离程度之间的关系，与两个峰的相对大小有关常用HPLC模式和仪器配置模式 色谱柱 泵 检测器吸附 C18 一元 UV键合相 C8 二元 PDA离子交换 Phenyl 三元 FL 尺寸排阻 CN 四元 RI疏水作用 NH2 EC亲和 SiO2 ELSD -SO3H MSDHPLC方法总结正相和反相键合色谱法正相键合色谱法固定相极性大硅胶-OH(或双-OH),硅胶-CN流动相极性小烃类+适量极性溶剂(CHCl3，CH3OH

19、，CH3CN)分析对象多用于极性或中等极性化合物的分离。还可用于分离异构体、极性不同的化合物以及不同类型的化合物。反相键合色谱法固定相极性小如硅胶-C18,硅胶-苯基流动相极性大甲醇-水、乙腈-水、水和无机盐的缓冲液分析对象多用于多环芳烃(PAHs)等低极性化合物分离;改变流动相配比,也可分离极性化合物;缓冲液可用于易离解的化合物，如有机有机酸、有机碱和酚类。正、反相色谱中极性和保留时间的关系正相色谱 反相色谱低极性流动相 高极性流动相 中等极性流动相 中等极性流动相待测物极性：ABC 硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；

20、6-甲苯 可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。色谱分离方法的选择分子量水溶性方法流动相2000可溶排阻色谱水不溶排阻色谱水2000不溶分配色谱(同系物)各种吸附色谱(异构物)各种排阻色谱(分子大小)各种可溶但不解离反相液液色谱各种排阻色谱水可溶且不解离阳离子交换色谱(碱)缓冲液阴离子交换色谱(酸)缓冲液可溶离子或非离子反相离子色谱缓冲液专业网站： 中国色谱网 www.SeP 中国分析仪器网 www.54PC.com1. 选择色谱柱未键合硅胶颗粒表面 C18键合硅胶颗粒表面2. 开机前准备 配制试剂、流动相 做好流动相的超声脱气工作 确定洗脱方式输液泵 进样器 色谱柱

21、柱温箱 检测器3. 启动程序 气泡原因：氧气 空气危害：流速不稳、基线起伏、尖锐噪音峰 脱气：超声波振荡；惰性气体鼓泡吹扫脱气；真空脱气。3.1 接通电源，脱气或赶气泡 3.2 用流动相平衡色谱柱 3.3 开启检测器 /常见检测器原理 见药物色谱分析4. 测定程序 编方法 编样品表 运行样品表 进样 打印结果5. 结束程序 结束时先关闭检测器灯 换用纯化水清洗仪器0.5h，再用65%甲醇清洗0.5h，最后用HPLC级甲醇清洗0.5h将泵的流速调至0关机时，先退出色谱工作站，再关闭液相色谱仪电源，最后关闭计算机； 清洗进样器（微量注射器）；用甲醇清洗进样口 填写仪器使用记录 出具报告注意事项：

22、所有进入色谱柱的溶剂和样品均需经0.45m或更小孔径微孔滤膜过滤。 不同型号仪器请参考操作手册或经培训后方可使用。 滤膜类型：聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。 醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质和其相关样品。 尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸，70%乙醇、二氯甲烷、不 适用于二甲基甲酰胺。 齐墩果酸的含量测定色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇水乙酸三乙胺 （88120.040.02 ）为流动相；检测波长220nm理论板数按齐墩果酸峰计算应不低于3000。 对照品溶液的制备 精密称取在60

23、减压干燥4小时的齐墩果酸对照品适量，加甲醇制成每1ml约含200g的溶液，即得。 供试品溶液的制备 取装量差异项下的内容物，研细，取细粉约150mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇约8ml，超声处理20分钟，放冷至室温，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 测定法 分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各20l，注入液相色谱仪，测定，即得。 本品每粒含女贞子以齐墩果酸（C30H48O3）计，不得少于2.0mg。HPLC 测定双黄连口服液中绿原酸的含量 色谱条件：色谱柱用Hypersil ODS2 C18柱(4. 6 mm200mm ,5m)；流动相为甲醇-0.4 %磷酸溶液(2476)；

24、检测波长327nm；检测器灵敏度AUFS为0.02；柱温30；流速1 mlmin-1。三、气相色谱法 （Gas Chromatography GC）1、定义 以气体为流动相（亦称载气）的色谱分析法称气相色谱法。 2、特点 分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快等。主要用于中药制剂中挥发油及其他挥发性组分的含量测定，还可用于水分、乙醇量、甲醇量和农药残留量的测定。但本法也存在一定局限性，它对挥发性差或遇热易分解破坏的物质难以分析。 3、分类 1）按固定相状态分类：气固GC、气液GC 2）按分离原理分类：吸附GC、分配GC 3）按色谱柱分类：填充柱GC、毛细管柱GC，后者分辨率高（n10）常用

25、于农残分析。 4、色谱柱 固定液类型极性例子分离对象烃类非极性角鲨烷、石蜡烷非极性物质分离硅氧烷类弱极性甲基硅氧烷、苯基硅不同极性物质分离中极性氧烷、氟基硅氧烷强极性氰基硅氧烷醇和醚类强极性聚乙二醇强极性物质酯和聚酯类中强极性苯甲酸二壬酯各类物质腈和腈醚类强极性氧二丙腈极性物质有机皂土弱极性芳香异构体5、常用检测器结构及原理常用的几种检测器：1.热导检测器(Thermal conductivity detector, TCD); 2.氢火焰离子化检测器(Flame ionized detector, FID); 3.电子捕获检测器(Electron capture detector, ECD)

26、; 4.火焰光度检测器(Flame photometric detector, FPD); 5.氮磷检测器（NPD）也称热离子检测器(Thermionic detector,TID); 6.原子发射检测器(Atomic emission Detector, AED);7.质谱检测器（Mass Detector, MSD）.6、开/关机操作开机操作 1.打开GC载气及支持气，设置压力在0.5MPa左右;2.打开计算机,进入Windows操作系统； 3.打开主机,等待自检完毕; 4.双击桌面上的online图标,进入化学工作站;5.在offline下不可以进online。 关机操作 1.如使用FI

27、D、NPD、FPD检测器，熄灭火焰；2.关闭检测器、进样口、Aux等加热区; 3.退出工作站,关闭计算机（不保存方法）; 4.待温度降至100度以下,关闭主机电源;5.关闭GC载气及支持体。7、仪器参数编辑8、进样方式 分流 不分流 动态顶空 9、信号采集过程调用方法/编辑一个新方法 指定数据文件路径和样品位置 ?等待仪器基线稳定 FID、NPD、FPD需点火并稳定基线，必要时调整基线位置 进样/StartKovats指数lx测定10、数据处理过程 调用标样数据优化图形优化积分参数建立校正曲线设置报告模式将数据处理文 件存入方法调用样品数据报告处理结果11、含量测定内标法 常用于药物分析。 外

28、标法 少用，因为GC进样量小，造成的误差较大。 1.色谱条件和系统适应性试验 （1）色谱条件 主要包括载气、色谱柱、检测器、固定液（相）测试温度、进样量、载体等。其中检测器种类、固定液品种、以及色谱柱的材质不得改变，其它的如柱子的内径和长度、 载体的种类和粒度、固定液涂布的浓度、载气的流速、柱温、进样量、检测器的灵敏度等可适当改变，以适应系统适用性试验的要求。载气：一般为N2，还可用H2（TCD）、He（很少用）。 色谱柱：玻璃柱和不锈钢柱 检测器氢火焰离子检测器（FID)：适用于有机物，灵敏度高，应用广泛。 热导检测器（TCD)：无机物、有机物均可，灵敏度较低，用于水分测定。 电子捕获检测器

29、（ECD):适用于含卤素、硫、氮等强电负性元素的化合物,主要用于农残测定。 柱填料 吸附剂：硅胶、氧化铝等。较少用。 高分子多孔小球：常用二乙烯苯乙基乙烯苯型的。气固吸附GC用于甲（乙）醇量、水分的测定。 涂渍固定液的载体（多用）：常用经酸洗并硅烷化的硅藻土（红色载体，白色载体） 气液分配GC。 固定液 常用甲基聚硅氧烷（SE-30、OV-17等）、聚乙二醇（PEG-20等），一般涂布浓度为525。（2）系统适应性试验（同HPLC）2.内标法（同乙醇量测定法） （1）标准液的制备 （2）供试液的制备 （3）校正因子（f）的测定 f为内标法特有的参数。 内标法测定时，检测器对内标物和对照品（即被

30、测成分）具有不同的响应值，故不能用峰面积直接计算的被测成分的含量，要引入校正因子。 校正因子（f）其含义为：内标物峰面积与其浓度之比（As/Cs）是对照品峰面积与其浓度之比（AR/CR）的多少倍。 选择内标物的原则：应是样品中不存在的纯物质。加入量应接近于被测成分。其色谱峰应位于被测成分色谱峰附近且与之完全分离。（4）样品的测定 12、实例1 十滴水软胶囊中樟脑含量的测定本品由樟脑、干姜、大黄、小茴香、肉桂、辣椒、桉油等七味中药制成，樟脑是其主成分之一，具升华性，故采用气相色谱法，以樟脑为对照品，薄荷脑为内标物，对其进行含量测定。 1.色谱条件与系统适用性试验 以聚乙二醇（PEG-20M）为固

31、定相，涂布浓度为10%，柱温150。理论塔板数按樟脑峰计算应不低于2000，樟脑峰与内标物质峰的分离度应大于2。 2.校正因子测定 精密称取樟脑对照品（R）50mg，置10ml量瓶中，精密加入薄荷脑内标物(S)50mg，加无水乙醇至刻度，摇匀，精密量取1 2l，注入气相色谱仪，AR=、As=，计算校正因子。 3.测定法 取本品内容物，混匀，取0.8g，精密称定（0.7956g），置具塞试管中，用无水乙醇提取5次，每次4ml，分取乙醇提取液，合并，转移至25ml量瓶中，精密加入薄荷脑125mg，使溶解，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(is)。精密量取12l，注入气相色谱仪测定，Ai、

32、As，计算即得（保留两位有效数字)。 解答问题 本法属于气液分配GC还是气固吸附GC？ 使用哪种载气？哪种检测器？采用的是外标-校正因子法还是内标-校正因子法？求算樟脑的含量。药典规定，本品每粒含樟脑不得少于53mg。（平均粒重0.425g粒） 求算校正因子（f）（保留四位有效数字) f =(As/Cs)/ (AR/CR) =(/5mg/ml)/ (/5mg/ml) =1.108 求算供试液中樟脑的浓度Ci（mg/ml） Ci= f Ai*Cs/As = 4.87 mg/ml求算药品中樟脑的含量（mg粒） 含量 (4.87mg/ml 25ml 425mg/粒) / 795.6mg 65（mg粒

33、）实例2 用气相色谱法同时测定石菖蒲挥发油中-细辛醚和-细辛醚的含量 色谱条件 HP-35 (二苯基-65%-二甲基硅氧烷共聚物)毛细管气相色谱柱； 程序升温：起始温度为30, 6/ min升至220, 保持5min；进样口温度：250；检测器温度：320； 进样量：2.0l；无分流进样； 溶剂：甲醇；载气：氦气；柱头压：5. 5104 Pa； 内标物：-萘酚。溶液制备 样品溶液的制备 用水蒸汽蒸馏法提取石菖蒲中的挥发油，称取适量，以-萘酚，以甲醇溶解，进样。 对照品溶液的制备 称取-细辛醚、-细辛醚对照品适量，加0.2mg/ml -萘酚的甲醇溶液制成含-细辛醚0.1mg/ml的对照品溶液(1

34、)和含-细辛醚0.5mg/l的对照品溶液(2)。实例3 GC法测定冰片中龙脑的含量四、毛细管电泳 Capillary Electrophoresis分析目的CE模式定量分析(小分子,离子)毛细管区带电泳 Capillary zone electrophoresis(CZE)胶束电动色谱 Micellar electrokinetic chromatography(MEKC)毛细管电色谱 Capillary Electrochromatography(CEC)蛋白分子量毛细管凝胶电泳-SDS Capillary Gel Electrophoresis(CGE)DNA/RNA大小毛细管凝胶电泳 C

35、apillary Gel Electrophoresis(CGE)蛋白/肽等电点毛细管等电聚焦 Capillary Isoelectric Focussing(CIEF)电渗流 Electro-Osmotic Flow (EOF) EOF是空心熔融石英毛细管柱或涂布毛细管柱所固有的eof = ( 0 ) / (4 )缓冲盐的介电常数缓冲盐粘度常数与温度成反比 zeta电势与缓冲液浓度和成反比而与管壁的电荷数成正比毛细管区带电泳 (CZE)：建立在电渗流基础上的迁移EOF迁移率 and 表观迁移率 + -高效毛细管电泳法测定麦当乳通颗粒剂中阿魏酸 对照品溶液（略）供试品溶液的配制 称取麦当乳通颗

36、粒剂2.0g于锥形瓶中，加入甲醇5 mL，超声提取30 min离心，取上清液；残渣加入甲醇5mL,超声提取30min,合并上清液,适当浓缩后加入内标溶液1 mL,用甲醇定容至10mL,作供试溶液。 电泳条件 在空心熔融石英分离毛细管柱(75m84 cm ,有效长度为79.5 cm)上，以12.5 mmol/L (pH 8.20)的硼砂缓冲液为运行缓冲液进行电泳，运行电压为16kV，柱温18，压力进样6kPa3s，在200 nm波长紫外检测。在此条件下，得到了满意的分离结果。五、挥发油测定法（Determination of Volatile Oil）1、意义 某些药品中的主要有效成分为挥发油，

37、故中国药典收载了挥发油测定法，采用水蒸气蒸馏法对药品中挥发油总量进行测定，以控制药品质量。例如，正骨水、牡荆油胶丸、保妇康栓满山红油滴丸等中挥发油的测定。 2、测定原理 首先利用挥发油挥发性用水蒸气蒸馏法将其提取完全；再利用其较强的亲脂性与水不相溶而分层，即可读取油的总量并求算出含量。 3、挥发油测定装置 4、测定方法 供试品需粉碎后过二号至三号筛，混匀再测定。 1）甲法 本法适用于测定相对密度在1.0以下的挥发油。取供试品适量（约相当于挥发油0.5ml1.0 ml），称重（准至0.01g），置烧瓶中，加水300ml500ml（或适量）与玻璃珠数 粒，振摇混合后，连接挥发油测定器与回流冷凝管。

38、自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分，并溢流入烧瓶时为止。置电热套中或用其他适宜方法缓缓加热至沸，并保持微沸约5小时，至测定器中油量不再增加，放置片刻，开启测定器下端的活塞，将水缓缓放出，至油层上端到达刻度0线上面5mm处为止。放置1小时以上，再开启活塞使油层下降至其上端恰与刻度0线平齐，读取挥发油量，计算即得。2）乙法 本法适用于测定相对密度在1.0以上的挥发油。取水约300ml与玻璃珠数粒，置烧瓶中，连接挥发油测定器。自测定器上端加水使充满刻度部分，并溢流入烧瓶时为止，再用移液管加入二甲苯1ml，然后连接回流冷凝管。将烧瓶内容物加热至沸，并继续蒸馏，其速度以保持冷凝管的中部呈冷却状

39、态为度。30分钟后，停止加热，放置15分钟以上，读取二甲苯的容积。然后照甲法自“取供试品适量”起，依法测定，自油层中减去二甲苯量，即为挥发油量，计算即得。5、含量计算 含量（V/W）= V0 / Ws100% 含量（W/W）= V0 D0 / Ws100% 含量（V/V）= V0 / Vs100% V0挥发油体积（ml）;D0挥发油密度（g/ml）;Vs样品体积（ml）;Ws样品重量（g）.6、实例 1.正骨水中挥发油的含量测定 2.牡荆油胶丸挥发油的含量测定 3.石菖蒲挥发油的含量测定六、紫外-可见分光光度法（Ultraviolet and Visible Spectrophotometry

40、） 定义 根据被测物质在紫外-可见光的特定波长处或一定波长范围内的吸光度，对该物质进行定性定量分析的方法称紫外-可见分光光法。 特点 本法操作简便，灵敏度高，常用于中成药含测。但本法不具分离功能，常用于总成分的测定。定量分析的理论基础 朗伯比尔定律 A = K C LA为吸收度，K为吸收系数，C为溶液浓度，L为溶液厚度 药典收载了三种测定方法 1.吸收系数法 仅用于UV，不需对照品。 2.对照品比较法 主要用于Vis，需用对照品。 3.标准曲线法 主要用于Vis，需用对照品。（原计算分光光度法取消）1、吸收系数法 1）原理 A = E1cm C L C = A /（E1cm L） C为供试液浓

41、度（g/100ml），A为供试液测得的吸收度，E为被测物质的百分吸收系数（药典给出），L为比色皿（液层）厚度（1cm）将求得的C值（供试液浓度）、样品溶液的稀释倍数和取样量或平均片（丸）重代入公式计算，即可求出药品中被测成分的含量。 2）特点 不需对照品随行测定，操作简便，仅用于紫外分光光度法。故需严格校正仪器，规范实验条件，做好前处理工作。3）实例 （1）前列舒丸（水蜜丸）中牡丹皮的含量测定 取本品切碎，取2g，精密称定（2.135g）；用水蒸气蒸馏，收集馏出液约450ml，置500ml量瓶中，加水稀释至刻度，照分光光度法（附录 A）在274nm 的波长处测定吸收度（A=0.333），按丹皮

42、酚（C9H10O3）吸收系数（）为862 计算，即得。本品含牡丹皮按丹皮酚(C 9 H 10 O 3 ) 计，每 1g不得少于0.53mg (1) 供试液浓度的计算 C供（g/100 ml）A / E L =0.（(2）牡丹皮含量计算 含量（mg/g） C供（g/100ml）500ml1000 / 100 m供（g）0.90（2）驻车丸（水丸）中总生物碱的含量测定 本品由黄连、炮姜、当归、阿胶等四味中药制成。取本品粉末（过三号筛）2g，精密称定，置索氏提取器中，加盐酸甲醇(1:100)的混合溶液适量，加热回流至回流提取液无色时为止，将提取液（必要时浓缩）移至50ml量瓶中，加盐酸甲醇(1:10

43、0)的混合溶液至刻度，摇匀。照柱色谱法（附录 C）试验，精密量取5ml，置中性氧化铝柱（5g，内径0.9cm,湿法装柱，用乙醇30ml预洗）上，用乙醇25ml分次洗脱，收集洗脱液，置50ml量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，精密量取2ml置50ml量瓶中，加0.05molL硫酸溶液至刻度，摇匀，照分光光度法（附录 A），在345nm的波长处测定吸收度，按盐酸小檗碱(C20H17NO4HCl)的吸收系数（）为728计算，即得。本品按干燥品计算，每1g含总生物碱以盐酸小檗碱(C20H17NO4HCl)计，不得少于 30.0mg。 2、对照品比较法 1）原理 在相同条件下分别配制供试品溶液和对照品溶液，在

44、规定波长处测定试品溶液和对照品溶液的吸收度后，按下式计算供试品溶液的浓度：C供(g/ml) =（A供/A对）C对 计算公式的推导：因为 供试品=对照品 所以 E供 = E对 A供 / C供 =A对 / C对A供 / A对 =C供 / C对 供试品的含量（%）=（C供 D供 V样 )/ W供 100% 式中，C对为供试品溶液浓度；D供为供试品溶液的稀释倍数；W供为供试品取样量；V样为样品溶液（未经稀释的供试品溶液）的体积。2）特点 对照品溶液与供试品溶液的浓度应尽可能接近，一般要求对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分标示量的100%10%。3）应用实例中国药典华山参片中总生物碱,

45、黄杨宁片中黄杨宁的含量测定等均采用本法。 黄杨宁片中黄杨宁的含量测定 本品为黄杨宁经加工制成的片剂。每片含环维黄杨星D0.5mg或1mg。 对照品溶液的制备 精密称取经105干燥至恒重的环维黄杨星D对照品25mg，置250ml量瓶中，加甲醇70ml使溶解，用0.05mol/L磷酸二氢钠缓冲液稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，用0.05mol/L磷酸二氢钠缓冲液稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml含环维黄杨星D10g）。供试品溶液的制备 取本品20片（每片含环维黄杨星D0.5mg），精密称定（2.050g），研细，精密称取0.1020g（约相当于黄杨0.5mg），置50ml量瓶

46、中，加0.05mol/L磷酸二氢钠缓冲液至近刻度，80水浴恒温1.5小时后取出，冷却至室温，加0.05mol/L磷酸二氢钠缓冲液至刻度，摇匀，离心6分钟（每分钟转速3000转），取上清液，即得。 测定法 精密量取对照品溶液与供试品溶液各5ml，分别置分液漏斗中，各精密加入溴麝香草酚蓝溶液（取溴麝香草酚蓝18mg，置250ml量瓶中，加甲醇5ml使溶解，加0.05mol/L磷酸二氢钠缓冲液至刻度，摇匀，即得）5ml，摇匀，立即分别精密加入氯仿10ml，振摇2分钟，静置1.5小时，分取氯仿层，置含0.5g无水硫酸钠的具塞试管中，振摇，静置，取上清液，照分光光度法（附录 A），在410nm的波长处分

47、别测定吸收度（A对 0.454,A供0.445），计算，即得。 本品每片含黄杨宁以环维黄杨星D(C26H46N2O)计，应为标示量90.0%110.0。【注】环维黄杨星D无紫外吸收，故本法采用酸性染料比色法 （1）求算供试液的浓度 C供（g/ml）=（A供 /A对 ）*C 对 = 9.8 （2）求算供试品的含量（标示量 ） 含量= C供（mg/ml）10-3 50ml 平均片重（mg）/ 取样量（mg） 标示量（mg） 100% = 96.53、标准曲线法 1）原理 配制一系列不同浓度（Ci）的对照品溶液（57份），在相同条件下分别测其吸收度(Ai)，以A为纵坐标，浓度C为横坐标绘制A-C曲线

48、，即得标准曲线（又称工作曲线）。在相同条件下测定供试品的A, 从标准曲线上查出与之对应的C，即可求出浓度和含量。亦可将一系列对照品溶液的C与相应的A进行一元线性回归，求出回归方程（相关系 r0.999），将供试品溶液的A代入回归方程，算出被测成分的浓度和含量。 标准曲线：A = a + b C. 2）特点 本法多用于可见分光光度法，由于影响显色反应的因素多，有的仪器单色光纯度较差，故测定时应用对照品同时操作。本法适用于批量样品的分析，当仪器和测定条件固定时，曲线可多次使用。 3）应用 主要用于总成分的测定。例如中国药典复方皂矾丸中的硫酸亚铁，独一味胶囊、益心酮片、消咳喘糖浆和排石颗粒中的总黄酮

49、、桂林西瓜霜中的总生物碱的含量测定。益心酮片总黄酮的含量测定 本品为山楂叶经提取总黄酮制成的片剂。 对照品溶液的制备 精密称取经120干燥至恒重的芦丁对照品25mg置50ml量瓶中，加乙醇适量，超声处理使溶解，放冷，用乙醇稀释至刻度，摇匀。精密量取20ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml含无水芦丁0.20mg）。标准曲线的制备 精密量取对照品溶液1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5.0 ml、6.0 ml，分别置25ml量瓶中，各加水至6ml，加5%亚硝酸钠溶液1ml，使混匀，放置6分钟。加10%硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6 分钟，加氢氧化钠试液

50、10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟；以相应的溶液为空白。照分光光度法（中国药典附录V B），在500nm为波长处测定吸度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。 测定法 取本品20片，除去包衣，精密称定0.2100g，研成细粉，精密称取0.5315g（约相当于5片的重量），精密加入稀乙醇25ml，密塞，摇匀，超声处理5分钟，静置3小时以上，滤过，精密量取滤液4ml，置50ml量瓶中，用水稀释到刻度，摇匀，再精密量取2ml，置25ml量瓶中，照标准曲线置备项下的方法，自“加水至6ml”起，依法测定吸收度，A=0.3620，并取同样量的供试品溶液，加水至25ml作空白。从标准曲线上

51、读出供试品溶液中芦丁的重量，计算每片总黄酮含量（以无水芦丁计）。中国药典规定本品每片含黄酮以无水芦丁（C27H30O16）计，不得少于25.0mg。标准曲线的制备 A0.0004510.8696C (r0.9998) C 0.092A 0. 计算供试溶液浓度 C（mg/ml）0.092 0.3620 0. 0.03335计算每片总黄酮含量 含量(mg/片) = (C25ml50ml25ml0.105g/片) / (2ml4ml0.5315g) = 25.7七、浸出物测定法 （Determination of Extractive） 定义 浸出物测定法系根据制剂中化学成分的溶解性，选择适当的溶剂

52、浸提(提取)样品，并测定浸出物（提取物）的含量，以此来控制药品的质量。意义 这是一种较为粗略的定量分析方法。但对于有效成分不明确或无法建立确切的定量分析方法的中药材及其制剂，尚具有一定的意义。 中国药典附录收载了三种测定方法：水溶性浸出物测定法、醇溶性浸出物测定法和挥发性醚浸出物测定法。有的品种还采用了乙酸乙酯浸出物测定法。供试品需粉碎，使能通过二号筛，并混合均匀。1、水溶性浸出物测定法 本法系以水为溶剂，对制剂中水溶性成分进行提取，并计算其在制剂中的含量(%)。本法包括冷浸法和热浸法。后者适用于不含或少含淀粉、粘液质等成分的样品且中成药较少用。 1）冷浸法 取供试品约4g，称定重量，置250

53、300ml的锥形瓶中，精密加入水100ml，塞紧，冷浸，前6小时内时时振摇，再静置18小时，用干燥滤器迅速滤过，弃去初滤液，精密量取滤液20ml，置己干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴蒸干后，于105干燥3小时，移置干燥器中，冷却30分钟，迅速精密称定重量，除另有规定外，以干燥品计算供试品中水溶性浸出物的含量（W/W %）。含量（W/W %）= (m i100mL) / (20mLm s) 100%m i为水溶性浸出物重量（g）m s为干燥供试品的重量（g）= 供试品重量 （1含水量%）2、醇溶性浸出物测定法 本法系以甲醇、乙醇或正丁醇为溶剂，提取药品中相应的醇溶性成分，并计算其含量（%）。正丁醇浸

54、出物测定法主要用于含较多皂苷类成分的制剂，专属性较强。 1）甲醇、乙醇浸出物的测定 照水溶性浸出物测定法测定。 2）正丁醇浸出物的测定 按各品种项下规定的方法测定。一般说来，水溶液制剂可直接用水饱和的正丁醇提取数次，合并提取液，置已干燥恒重的蒸发皿中，蒸干，置105干燥3小时，移置干燥皿中，冷却30分钟，迅速精密称定重量，计算供试品中正丁醇浸出物的含量（W/V %）。固体制剂可先加水溶解，移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取数次，合并提取液，照上述方法蒸干，干燥，称定浸出物重量，计算出制剂中正丁醇浸出物的含量（W/W%）。 3）实例 （1）儿康宁糖浆正丁醇浸出物的测定 （2）刺五加浸膏的甲醇浸出物测定3、挥发性醚浸出物测定法 本法以乙醚为溶剂，对制剂中挥发性醚溶性成分进行提取，并计算其在制剂中的含量（W/W %）