生物化学课件：10第十四章 DNA的生物合成2

1、复 习,复制的基本特征： (3个),半保留复制 双向复制 半不连续复制,一、半保留复制,DNA生物合成时，亲代双链DNA解开为两股单链，各自作为模板，依据碱基配对规律，合成序列互补的子链DNA。这种复制方式称为半保留复制。,复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。,双向复制,（二）真核生物：,真核生物多染色体，多起始点，多复制子的复制。 复制子(replicon):是含有一个复制起点的独立完成复制的功能单位，是从一个DNA复制起始点起始的DNA复制区域。,(一）原核生物：只有一个复制起始点，一个终止点,前导链（leading stran

2、d）: DNA复制过程中，沿着解链方向生成的子链DNA的合成是连续进行的。 后随链（lagging strand）:另一股链的复制方向与解链方向相反，不能连续延长，只能分成若干小片段分别合成，然后连接起来形成新链。 冈崎片段（Okazaki fragments)：后随链中的小片段。,前导链连续复制而后随链不连续复制的方式称为半不连续复制。,半不连续性复制,DNA聚合酶（DNA polymerase）,全称：依赖DNA的DNA聚合酶,1、聚合活性： 5 3方向，催化四种dNTP一个一个地连接到DNA子链上去。 2、核酸外切酶活性（两种情况） 3 5外切酶活性，能辨认错配的碱基对，并将其水解。 5

3、 3外切酶活性，能切除引物和突变的 DNA片段。,原核生物与真核生物的DNA聚合酶,原核生物,真核生物,DNA pol ,DNA-pol ：,DNA-pol ： 校读、修复和填补缺口,DNA-pol ：,DNA pol ：,校读、修复和填补缺口,参与DNA损伤的应急修复,DNA-pol （）： 参与应急修复,延长子链的主要酶， 有解螺旋酶活性。,DNA-pol ： 线粒体DNA复制,DNA-pol ： 起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶,全酶组装至模板，增强核心酶活性,功能：原核生物复制延长中合成前导链和后随链。,DNA-pol ,夹稳模板，滑动,核心酶,核心酶,亚基:合成DNA 亚基

4、: 具有35外切酶活性（校正功能） 亚基: 组装作用,（、 6种 亚基）,（含1对-亚基）,复制的保真性,（一）复制遵守严格的碱基配对规律进行 （二）聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能 （三）复制中出错时有即时的校对功能,染色体是由DNA和组蛋白经高度压缩形成的复杂结构。DNA复制时，首先需要把DNA的超螺旋解开。 DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。,三、复制中的解链伴有DNA分子拓扑学变化,（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态,原核生物复制中参与DNA解链的相关蛋白,DnaA(dnaA) 辨认复制起始点,DnaC(dnaC) 运送并协同DnaB,拓扑

5、异构酶 （gyr, ） 理顺DNA链,单链结合蛋白 SSB 稳定已解开的单链,解旋酶 DnaB(dnaB) 解开DNA双链,引物酶 DnaG(dnaG) 催化RNA引物生成,1.解旋酶 (helicase)：DnaB,DnaB,DnaA、B、C,ATP,作用：利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开 成为两条单链。,C,B,A,2.单链结合蛋白（SSB）,作用: 1、防止单链DNA重新形成双链 2、防止单链DNA被核酸酶水解,特点：由177个aa组成的同源四聚体，结合单链 DNA跨度约32bp,不断地结合和解离。,DnaB,单链结合蛋白,作用：该酶以DNA为模板，合成一段RNA引物。 DN

6、A复制是在该引物3-OH末端加入dNTP。,因为DNA聚合酶不能催化两个游离的dNTP聚合，而引物酶可以催化两个游离的NTP聚合.,3.引物酶 (primase),为什么要合成引物 ?,引物酶和RNA聚合酶的异同,1、相同点：催化游离NTP聚合 2、不同点：,引物酶,RNA聚合酶,利福平,（）,拓扑异构酶对DNA分子的作用是既能切开又能连接磷酸二酯键，使DNA不至于打结，适当时候又把切口封闭，使DNA的拓扑异构体发生改变。,（二）DNA拓扑异构酶 (DNA topoisomerase),DNA分子是反向平行、右手螺旋的双链结构。每一个螺旋有10个碱基对，螺距为3.4nm。 碱基垂直螺旋轴居双螺

7、旋内側，与对侧碱基形成氢键配对（互补配对形式：A=T; GC） 。 疏水作用力和氢键共同维持着DNA双螺旋结构的稳定。,DNA双螺旋结构具有特征性 （Watson, Crick, 1953）,DNA的超螺旋结构,超螺旋结构(superhelix 或supercoil) DNA双螺旋链再盘绕即形成 超螺旋结构。,正超螺旋(positive supercoil) 盘绕方向与DNA双螺旋方同相同,负超螺旋(negative supercoil) 盘绕方向与DNA双螺旋方向相反,11个 螺旋,超螺旋局部解开后,DNA复制过程中正超螺旋的形成,复制过程中正超螺旋的形成,超螺旋解开前,2,9,拓扑异构酶,

8、切断DNA双链中一股链，适当时候封闭切口,使DNA变为松弛状态。 反应不需ATP。,拓扑异构酶,无ATP时，切断处于正超螺旋的DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。 再利用ATP供能，连接断端。,拓扑异构酶的作用,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,四、DNA连接酶 (DNA ligase),DNA连接酶的特点:,1、消耗ATP; 2、只能连接碱基互补基础上的双链中的单链缺口 （不能连接单独存在的DNA或RNA单链）。,DNA连接酶的功能,1、在复制中起最后接合缺口的作用； 2、在DNA修复、重组中起接合缺

9、口作用； 3、基因工程的重要工具酶。,复制叉的结构及参与复制的酶与因子,原核生物DNA复制过程,第三节,一、复制的起始,二、复制的延长,三、复制的终止,一、复制的起始,1. DNA解开成单链，形成复制叉，提供模板,3. 合成引物，提供3-OH末端,2. 形成引发体,（一）DNA的解链,1、复制有固定起始点,2、DNA解链需多种蛋白质参与,3、解链过程中需要DNA拓扑异构酶,3,5,5,3,SSB,含有解螺旋酶DnaB 、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,DnaG 引物酶,DNA 拓扑 异构酶 ,（二）引发体形成和引物合成,引物的合成,3,5,5,3,SSB,DNA

10、 拓扑 异构酶 ,合成引物,DnaG 引物酶,解链方向,1、引物：短链RNA分子 2、合成方向： 53 3、 提供3-OH末端,二、复制的延长,酶：DNA-pol 原料：dNTP 化学本质：磷酸二酯键的生成 合成方向： 53,领头链：连续 随从链：不连续,半不连续复制,OH 3,3,复制的延长,1、前导链复制先于后随链 2、两链在同一酶催化下进行延长,DNA-pol ,前导链,后随链,三、复制的终止,切除引物：RNA酶/ DNA-Pol I 填补空缺：DNA-Pol I 连接切口：DNA连接酶,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,RNA酶/ DNA-p

11、ol ,切除引物,填补空缺,连接切口,DNA连接酶,DNA-pol ,后随链上不连续性片段的连接：,真核生物DNA复制过程,第四节,（一）复制的起始,（二）复制的延长,（三）复制的终止,注意：原核生物 E.Coli 的DNA是环状双链；,真核生物为线状双链DNA。,真核生物的DNA生物合成,复制时间：分裂间期的S期,打开双链形成复制叉 引发体 RNA引物,多染色体、多起始点、多复制子 复制起始点：比E.coli的oriC短、 富含AT序列 复制有时序性：复制子以分组方式激活 而不是同步启动,特点,一、真核生物复制的起始 与原核生物基本相似,引物酶：DNA-Pol 解螺旋酶： DNA-Pol 拓

12、扑酶 增殖细胞核抗原（PCNA） 复制因子（ RPA SSB、RFC等）,复制起始需要的一些酶和因子,PCNA为同源三聚体，可形成闭合环形的“DNA夹子” (与DNA-Pol的-亚基有相同的功能和相似的构象。) PCNA是Pol 的可滑动的夹子： 在RFC的作用下 PCNA结合于引物-模板链上，使 Pol 获得持续合成能力。 PCNA在复制起始和延长中具有关键作用。,增殖细胞核抗原（PCNA）,引物,二、真核生物复制的延长,延长的主要酶： DNA-Pol 延长过程：和互换,引物、冈崎片段比原核生物短,后随链,前导链,亲代DNA,Pol 合成RNA-DNA引物,先合成一小段RNA,利用DNA聚合

13、酶活性将引物延伸，产生起始DNA（iDNA）短序列，形成RNA-DNA引物,Pol 脱离模板，发生DNA聚合酶/转换,功能：合成前导链和后随链 DNA聚合酶/转换： 在复制叉及引物形成后DNA-Pol通过PCNA的协同作用，逐步取代DNA-Pol，在引物的3-OH上连续合成子链； 发生DNA聚合酶/转换的原因是DNA-Pol不具备持续合成能力。,DNA聚合酶,复制延长的总结,在复制叉及引物形成后，DNA聚合酶/转换； 真核生物以复制子为单位进行复制，其引物和冈崎 片段都比原核生物的短； 真核生物冈崎片段的长度大致与一个核小体所含 DNA的碱基数或其若干倍相等； 真核生物DNA-Pol的催化效率

14、远比原核生物慢，但 复制的整体速度不慢。,三、真核生物复制的终止,切除引物：RNA酶、核酸外切酶 填补空隙：DNA-Pol / 片段连接：连接酶(冈崎片段、复制子）,DNA合成后，立即组装成核小体,问题？ 线性染色体两端DNA子链上，5端RNA引物去除后留下空隙该如何填补？,已知： 1、DNA-Pol 不能催化两个游离的dNTP聚合 2、DNA单链的母链易被DNase水解。,四、染色体末端复制端粒酶,2009年诺贝尔生理学或医学奖,发现了端粒和端粒酶保护染色体的机理。,伊丽莎白布莱克本 Elizabeth Blackburn,卡罗尔-格雷德 Carol Greider,杰克绍斯塔克 Jack

15、Szostak,端粒(telomere),真核生物染色体线性DNA分子末端膨大的特殊的结构。,结构特点,由末端DNA序列和蛋白质构成。 该序列是多次重复的富含T、G碱基的短序列（TnGn）x。,端粒酶 (telomerase),端粒酶RNA（An、Cn）x ( hTR) AAAACCCCAAAACCCC. 端粒酶协同蛋白 ( hTP1) 端粒酶逆转录酶 ( hTRT) 功能：提供RNA模板、催化逆转录 端粒酶通过爬行模型的机制维持染色体的完整,组成,端粒酶靠其hTR（AnCn）x 辨认及结合母链DNA（TnGn）x的重复序列并结合至其3端，并发生移位。,端粒酶以hTR（AnCn）x 为模板，以

16、逆转录的方式复制延伸母链,端粒DNA末端,内在模板RNA,DNA-Pol,端粒酶靠其hTR（AnCn）x 辨认及结合母链DNA（TnGn）x的重复序列并结合至其3端，开始以逆转录的方式复制延伸母链。,复制一段后，hTR（AnCn）x 爬行移位至新合成的母链3端再以逆转录的方式继续复制延伸母链。,延伸至足够长度后，端粒酶脱离母链，代之以DNA-pol，此时母链形成非标准的G-G发夹结构允许其3-OH反折，同时起引物和模板的作用，在DNA-pol的作用下完成末端双链的复制。,逆转录和其他复制方式,第五节,逆转录( reverse transcription ),一、逆转录病毒和逆转录,逆转录：就是

17、以RNA为模板，由逆转录酶催化4种dNTP聚合、产生DNA的过程，又称RNA指导的DNA合成。 逆转录病毒：又称反转录病毒，是RNA病毒的一种，它们的遗传信息不是存录在DNA，而是存录在RNA上，此类病毒多具有逆转录酶。,是多功能酶，有三种酶活性：,RNA指导的DNA聚合酶活性 RNase H活性 DNA指导的DNA聚合酶活性,逆转录酶( reverse transcriptase ) 全称：依赖RNA的DNA聚合酶,逆转录的过程,RNA 模板,逆转录酶,DNA-RNA 杂化双链,逆转录酶( RNase ),单链DNA,逆转录酶,双链DNA,逆转录研究的意义,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学

18、研究中的重大发现。 逆转录现象说明： 至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。 对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。,小 结,复制特点： (3个),半保留复制 2. 双向复制 3. 半不连续复制,原核生物与真核生物参与复制的关键酶,原核生物,真核生物,拓扑异构酶,SSB,DnaC,DnaB（解螺旋酶）、,DnaA、,引物酶,连接酶,DNA pol 、,拓扑异构酶,RPA,解螺旋酶: DNA-Pol ,引物酶: DNA-Pol ,连接酶,DNA pol 、,DNA聚合酶活性（作用）（2方面） 1、聚合活性： 5 3方向，催化四种dNTP一个一个地连接到DNA子链上去。 2、核酸外切酶活性（两种情况） 3 5外切酶活性，能辨认错配的碱基对，并将其水解。 5 3外切酶活性，能切除突变的 DNA片段。,原核生物与真核生物的DNA聚合酶,原核生物,真核生物,DNA pol ,核心酶：聚合、校正 -复合物 DNA夹子,DNA-pol 、 DNA-pol ,DNA-pol ： 校读、修复和填补缺口,复制引发和延伸过程中发生 DNA聚合酶/转换,DNA-pol ：,DNA pol ：,校读、修复和填补缺口,参与DNA损伤的应急修复,DNA-pol （）： 参与应急修复,