分子生物学课件：基因敲除

1、基因的生物学功能鉴定技术,第一节 转基因技术 第二节 基因敲除技术 第三节 RNA 干涉,基因功能的鉴定技术,基因敲除 (gene knock-out),基因敲除 (gene knock-out) 属于基因打靶技术的一种，利用同源重组的原理，在ES细胞中定点破坏内源基因，然后利用ES细胞发育的全能性，获得带有预订基因缺陷的杂合子，通过遗传育种最终获得目的基因缺陷的纯合个体。,概念*,（*为教学重点）,美国犹他大学Eccles人类遗传学研究所 马里奥卡佩奇 MarioR.Capecchi 英国卡迪夫大学卡迪夫生命科学学院 马丁埃文斯 MartinJ.Evans 美国北卡罗来纳州大学教会山分校医学

2、院 奥利弗史密斯 OliverSmithies,基因敲除技术发展及成果,1989年成功对 一只老鼠进行 基因打靶,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2007,Mario R. Capecchi,Sir Martin J. Evans,Oliver Smithies,2. 基本原理,利用DNA同源重组的原理，在活体内将特定基因从染色体上剔除的过程。,3. 操作流程 *,将基因敲除载体导入ES细胞：重组置换,用选择培养基筛选已击中的细胞将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物（缺失的杂合子小鼠）。,构建基因敲除载体,通过杂合子后代交配，获得纯合子基

3、因敲除小鼠；对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。,构建基因敲除载体,基因敲除载体的特点：,待敲除基因的同源臂序列 阳性筛选标记基因（NeoR) 阴性筛选标记基因 (TK gene),打靶载体,问题：如何构建打靶载体？,Positive screening marker gene,Homologous arms,HSV-Tk gene,Neo,Restriction enzyme,打靶载体,Linearize the targeting vector,Homologous arms of gene waiting for being knocked out,Negative screeni

4、ng marker gene: TK gene,NeoR,*,HSV-TK,基因敲除载体的构建过程：,将待敲除基因切除大部分使其失活，留下用于重组的同源臂,同源序列中间插入了NeoR基因,构建打靶载体,在同源臂的外侧线性化载体,ES cell,P,Targeting vector,Restriction enzyme,如何筛选出同源重组的ES 细胞呢？,2. 将基因敲除载体导入ES细胞：重组置换,小鼠受精卵发育第35天（分裂至8 个细胞左右）时的胚泡细胞；能在体外培养，具有发育的全能性。,ES细胞中同源重组的示意图,同源重组在哺乳动物细胞中发生的概率（10-5），一个合适的筛选方法对于减小工作

5、量是十分必要的。 如何筛选出同源重组的ES 细胞呢？,打靶载体,NeoR,阳性筛选标记基因（NeoR) 抗新霉素抗药基因。G418是一种和新霉素结构相似的抗生素。G418可以筛选所有能表达neo基因的细胞。 阴性筛选标记基因 (TK gene),HSV-TK基因的表达产物是胸苷激酶，此酶能分解单核苷酸类似物，并且分解产物是有毒性的。 普通细胞因无TK 基因 ，可在含单核苷酸类似物的培养基中生长。 如果Tk 基因进入细胞，在含单核苷酸类似物的培养基中生长时会因为以上分解反应产生的有毒物质而死亡,HSV-TK,正负筛选系统,筛选标志在这个过程中如何发挥作用的？,1. 同源重组,正负筛选系统工作原理

6、,P53 gene,10-5-10-6,Neo gene,Neor基因进入ES细胞的基因组,P53基因被替换,在G418、单核苷酸类似物的培养基中，可以存活。,Positive-negative selection,Homologous recombinants,G418 Neomycin (positive selection) kills the non-insertions; Gancyclovir (negative selection) kills the random insertions In survival cells, P53 gene is replaced by Neo

7、.,Medium with G418 在体内试验时，只能选择 该方法。,将siRNA 转染到细胞内：通常在3-7天可以维持较高的基因表达抑制效应。效应期的长短取决于细胞的增殖速度 无法长期保存转染细胞 转染效率无法保证！,效应期的长短,费用,高,中等,可否进行标记,可以,不可以,4. RNAi技术存在的问题（1）,siRNA复合物除了预期的靶点，还能潜在地靶向多个基因。这个现象即“脱靶效应 (off-targeting) *”。,问：你所设计的RNAi ，会不会干涉其它基因的翻译？,siRNA的Off-targeting 的定义及其产生原因,问：RNAi为什么可能存在在脱靶 (off-targ

8、eting)效应？,正义链与RISC结合,解决办法：,链偏好性（Strand bias）* 使RISC只结合SiRNA的反义链。,RNAi 技术还需进行不断的完善！,siRNA并不能接近所有与其同源的mRNA分子，有些mRNA序列位于RNA的二级结构中，或与蛋白质形成紧密的复合物，碍阻了siRNA 对靶序列的识别。因此，往往要经过不断的摸索才能选择出最佳的靶序列。 目前虽然可将siRNA 高效地导入体外培养的细胞。但，如何高效地、靶向性地导入动物体内特定组织，还是一个急需解决的问题！,4. RNAi技术存在的问题（2）,（1）研究基因的功能,5. RNAi 技术的应用,高效率 易于操做 可实现

9、多种基因突变,RNAi ( knockdown) VS knockout,RNAi 技术的优点：,利用RNAi能在短时间内高效特异地抑制靶基因表达的特点，可以很方便地研究基因的功能。,肿瘤细胞,（2） 基因治疗的新策略,肿瘤治疗： 由于单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi技术能同时特异性阻断多个癌基因的表达。,如何设计实验？ 1. Dicer 功能 2. SiRNA 的选择 3. 在体内研究功能,Suppression of heat shock protein 27 induces long-term dormancy in human breast cancer,抑制

10、HSP27, 会诱导人乳腺癌长期休眠,-Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 May 29;,基因功能研究的实例,Human breast cancer cell line (MDA-MB-436),Angiogenic cell variant,Non-angiogenic cell variant,The researchers established an experimental model for the study of human tumor angiogenesis and dormancy.,Develop into big Tumor,Remain

11、dormant without progression into detectable disease,Human breast cancer cell line (MDA-MB-436),Angiogenic cell variant,Non-angiogenic cell variant,Western blot analysis,Result 1. Heat shock protein 27 (HSP27) is highly up-regulated in angiogenic breast cancer cells, compared with nonangiogenic cells

12、.,Compared with the original cell line, expression of HSP27 protein was 20% lower in HSP27KD-1 cells, 70% lower in HSP27KD-2 cells, 84% lower in HSP27KD-3 cells.,Angiogenic breast cancer cells were transduced with lentiviruses encoding three different shRNAs against HSP27 (HSP27KD-1, HSP27KD-2, and

13、HSP27KD-3).,Result 2. Angiogenic breast cancer cells HSP27 -RNAi,具有促血管新生作用的人乳腺癌细胞接种到SCID小鼠,HSP27基因被干涉的 人乳腺癌细胞 （HSP27KD-3) 接种到SCID小鼠,To determine the effect of HSP27 suppression on tumor growth, SCID mice were inoculated with control or HSP27KD-3 cells.,RESULT 3. Up-Regulation of HSP27 in Nonangiogen

14、ic Human Breast Cancer Cells Induces Expansive Tumor Growth in Vivo.,Nonangiogenic cells (controll) with intrinsically low HSP27,Nonangiogenic cells trancfected with HSP27-GFP, could express high level of HSP27,Transfer into SCID mice,Transfer into SCID mice,? Why is HSP27 responsible for promoting

15、tumor progression?,Result 4. Down-regulation of HSP27 leads to Reduced secretion of VEGF-A, VEGF-C, and basic fibroblast growth factor.,Blue bar means HSP 27 gene-silenced angiogenic cells by the third SiRNA, in which expression of VEGF-A, VEGF-C, and bFGF was significantly reduced,Red bar means ang

16、iogenic cells control,which could secret VEGF-A, VEGF-C, and bFGF,They analyzed the secretion of important angiogenic factors by ELISA in HSP 27 gene-silenced angiogenic cells.,HSP27 promotes tumor growth by up-regulating the secretion of angiogenesis-related growth factors,基因功能分析总结,基本思路： 一、将外源基因导入受

17、体细胞或生物体内 获得新基因 获得额外拷贝的基因 二、失活或抑制细胞或生物体内原有基因 在DNA水平 在mRNA水平,一、将外源基因导入受体细胞或生物体内,相关技术： 基因转染 (gene transfection) 细胞水平转基因 转基因技术(transgenic technique),（1）转基因小鼠、转基因羊 （2）转基因植物,在DNA水平上： 基因敲除 (gene knock-out) 条件性基因敲除 (conditional gene knock-out) TALEN CRISPER/Cas9,二、失活或抑制生物体内原有基因（DNA水平）,在RNA水平上： 反义RNA (anti-sense RNA) RNA干涉 (RNA interference),该基因表达时，呈现某种功能； 该基因被敲除时，该功能消失或下降； 该基因恢复时，该功能得到恢复。,基因功能分析,基因功能研究一般是在活细胞或生物体内、通过观察基因的终产物而实现的