分子生物学课件：实验二PCR产物T-A连接及连接产物转化

1、实验二、PCR产物的T-A连接及连接产物转化,第一部分：PCR产物的电泳及回收 第二部分：PCR产物与T载体的连接（T-A连接） 第三部分：连接产物的转化,1. 电泳样品制备： 在50 l PCR产物中，加入 6 ul 上样液，混匀。 （上样液：10Loading buffer 或 6Loading buffer） 2. 上样： 将上述样品加入凝胶加样孔中。 注意：上样DNA Marker。 3. 电泳：100 伏，30分钟。,实验第一部分 PCR产物的电泳及回收,GAPDH gene 片段 (746bp),750bp,2000bp,1000bp,500bp,250bp,100bp,Marke

2、r 1 2,？,？,4. PCR产物的电泳结果观察及分析,GAPDH gene 片段 (746bp),750bp,2000bp,1000bp,500bp,250bp,100bp,Marker 1 2,（1）在UV灯下，用手术刀片将含DNA片段的琼脂糖凝胶切下，放入封口膜中； （2）将切下来的胶块，标记好姓名，-20冰箱中 。 （3）放在封口膜内直接挤压，用加样器吸取挤压后得到的液体。,5.挤胶法回收PCR产物,3,3,A-,-A,T - Vector,T,T,5,5,-3,3-,1. Taq DNA聚合酶：PCR产物的3端突出一个A,2. 商业化的T载体：在3端多出一个T,3. 两者的互补碱基

3、先退火结合(粘性末端连接)，然后连接酶在缺口形成磷酸二酯键。,T-A 连接原理：,实验第二部分 PCR产物与T载体的连接,连接反应的关键:目的基因片段与载体的比例，一般片段与载体的比例为3:1（摩尔比）。,注意事项：,2. 使用T-载体时，避免反复冻融，防止T的断裂丢失。如果目的片段与T载体连接后，主要以自身环化为主，要考虑T 可能已经丢失。,1. 按下列配方进行连接反应： 回收的PCR产物（DNA片段） 7 l T-载体 1 l 10 X Ligation buffer 1 l T4 DNA ligase 1 l 终体积 10 l,T-A连接的步骤：,注：最后加入工具酶（T4 DNA lig

4、ase ）,2. 轻弹管底混合，离心机甩一下。 3. 将连接反应管置25水浴20min。,（1）原理： 大肠杆菌在低渗 CaCl2 溶液的条件下，细菌变得膨胀而易于外源基因的导入。,1. 感受态细胞的制备,（2）注意事项： （1）在冰上操作。 （2）无菌操作。超净台的火焰附近是无菌区。枪头、微量离心管、试剂等均已高压消毒，并已经放置于超净台中。,实验第三部分 连接产物的转化,将大肠杆菌在LB琼脂培养基上划线，置37oC孵箱培养12-16小时； 从琼脂平板上挑取单菌落，接种于2ml LB培养基中，37oC, 225rpm水浴摇床中震荡培养12-16h； 取1ml上述培养物接种于100ml LB培

5、养基中，37oC, 225rpm水浴摇床中震荡培养，直至OD值为0.5左右(约3小时)。 取1ml 菌液，冰浴 5 min； 6000rpm离心 3 min，弃上清，轻轻弹匀菌体沉淀，加入500l 冰冷的100mmol/L CaCl2 致敏液悬浮细胞，冰浴5分钟； 重复步骤5，感受态细胞制备完毕。感受态细胞在4oC可保存1周；若长期保存：加甘油至终浓度15%， 分装后置-70oC。,（3）操作步骤：,10 l 连接产物可以进行 14 次转化。 转化时一般要加入少量的DMSO，作用：防止细胞被胀破、提高转化效率。,热休克作用原理： Ca2+ 诱导大肠杆菌成为感受态细胞， 感受态细胞经热休克（42

6、oC，4560 s） 发生收缩作用，使细胞膜出现空隙， 细胞外的DNA进入细胞。,2. 连接产物的转化,实验第三部分 连接产物的转化,在冰上，向感受态细胞中加入 3 l DMSO，轻弹管底混匀。再加入10 l 连接反应液，温和混匀。 置冰上10分钟； 42oC，45秒。然后迅速放回冰中 5 分钟； 将转化后细菌加入到1ml LB培养液中； 37oC, 225rpm 摇床中震荡培养 30min；,6,000rpm离心 20s，弃掉800 l上清, 用剩余液体重悬菌体； 将上述菌液涂匀于含有Amp的LB琼脂培养板； 待菌液被平板吸收后，将平皿倒置于37oC孵箱中培养12-16h。,播放录像: 1、2 。,操