真核基因表达系统

1、第八章 真核表达系统 Chapter 8 Eukaryotic expression system,概述( introduction ) 真核基因结构及表达调控特点( Features of eukaryotic gene structure and regulation) 真核表达系统(eukaryotic gene expression system) 酵母表达系统(yeast expression system) 哺乳动物细胞表达系统(mammalian cell expression) 昆虫细胞表达系统(insect cell expression ),内 容,第一节 概述,一、真核基

2、因组的复杂性 二、原核表达系统的局限性 三、真核表达系统的必要性及优势,一、真核基因组的复杂性,1. 真核基因组巨大 大肠杆菌基因组约4106bp，哺乳类基因组在109bp数量级 大肠杆菌约有4000个基因，人则约有10万个基因 2. 真核生物遗传信息复杂 原核生物的基因组基本上是单倍体，而真核基因组是二倍体 真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹在核膜内，核外还有遗传成分(如线粒体DNA等)，这就增加了基因表达调控的层次和复杂性。 ,细菌多数基因按功能相关成串排列，组成操纵子，共同开启或关闭，转录出多顺反子(polycistron)的mRNA； 真核生物则是一个结构基因转录生成一

3、条mRNA，即mRNA是单顺反子(monocistron)，基本上没有操纵子的结构。 真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亚基构成的，这就涉及到多个基因协调表达的问题，真核生物基因协调表达要比原核生物复杂得多。,3. 真核生物基因协调表达,4. 真核生物基因编码复杂,原核基因组的大部分序列都为基因编码，而核酸杂交等实验表明：哺乳类基因组中仅约10%的序列为蛋白质、rRNA、tRNA等编码，其余约90%的序列功能至今还不清楚。 原核生物的基因为蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核生物为蛋白质编码的基因绝大多数是不连续的，即有外显子(exon)和内含子(intron)，转录后需经剪

4、接(splicing)去除内含子，才能翻译获得完整的蛋白质，这就增加了基因表达调控的环节。 原核基因组中除rRNA、tRNA基因有多个拷贝外，重复序列不多。哺乳动物基因组中则存在大量重复序列(repetitive sequences)。 真核生物mRNA 5有帽状结构，3末端有PolyA尾巴,1、没有转录后的剪接和加工系统 2、缺乏翻译后加工修饰系统：不能进行糖基化、磷酸化、甲基化的修饰，影响某些蛋白的活性。,二、 原核表达系统的局限性,3、在原核细胞中表达的真核蛋白不稳定 易被细菌蛋白酶降解; 难实现真正的分泌出胞，其产量很低; 而且容易出现信号肽不被切割，或不在特异位置上切割。 表达产物常

5、以包涵体的形式存在，后期变性、复性的效率低 4、内毒素的污染 (contamination of endotoxin),1. 具转录后加工系统: 2. 具翻译后修饰系统 3. 可实现真正的分泌表达,三、真核表达系统的必要性及优势 ( advantages of eukaryotic expression system ),（一）真核基因表达调控特点 -多层次、多方面 （二）真核基因表达的调控模式,第二节 真核基因表达调控特点Features of Eukaryotic gene structure and expression,真核基因表达的调控模式 ( The regulating mode

6、l of eukaryotic gene expression),1、转录前水平(基因组水平) ：gene level 2、转录水平调控: transcription level 3、转录后调控: post-transcription level 4、翻译水平的调控: translation level 5、翻译后修饰: post-translation modification,1、转录前水平(基因组水平)： gene level 基因结构的改变、稳定持久、不可逆，组蛋白修饰，DNA甲基化等,2. 转录水平调控 顺式调控元件(cis-acting element) 反式作用因子(trans-

7、acting factor),（1 ）顺式调控元件(cis-acting element) 结构基因周围能与特异转录因子结合而启动 转录的DNA序列，主要包括： 起正性调节作用：启动子、增强子 起负性调节作用：沉寂子，终止子，加尾信号,启动子 位于基因5末端与转录起始有关的核苷酸序列。作用特点是近距离作用、具有方向性、空间位置较恒定。一般包括 核心启动子元件（core promoter elements) ： 指RNA聚合酶起始转录所必需的最小的DNA序列，决定基因转录的精确起始位点产生基础水平的转录，包括：转录起始点及-30区的TATA-box 上游启动子元件（upstream promot

8、er elements) 包括 -70到-80bp区域的CAAT盒及其两侧的GC盒，协同决定转录的基础效率 组织特异性元件 诱导性启动子元件,真核启动子结构模式图,核心启动子元件,上游启动子元件,哺乳类RNA聚合酶启动子中常见的元件,增强子(enhancer) 是一种能够提高转录效率的顺式调控元件 增强子要有启动子才能发挥作用，但增强子对启动子没有严格的专一性 无方向性（序列、位置） 远距离作用（1-4kB） 无基因特异性 具组织特异性,构建载体,沉寂子（silencer)或衰减子（dehancer) 是一类抑制基因转录的调控因子，作用方式 与增强子相同 转录终止信号： 控制基因转录的终止，由

9、polyA上游的10-20bp处的加尾信号（AATAA）和poly A下游的G/T簇构成,（2）反式作用因子(trans-acting factor),由位于不同或相同染色体上相距较远的 基因所编码的蛋白质因子，通过与顺式调控 元件和RNA聚合酶的相互作用而调节基因转 录活性。,转录信号1,P,Trans-acting factor,Trans-acting factor (DNA结合蛋白）,Cis-acting factor,A gene,mRNA of A,Protein A,B gene,mRNA of B,Protein B,DNA,3、转录后的修饰 内含子的剪接 外显子的拼接 mRN

10、A的加尾和加帽 mRNA的稳定性,4、翻译水平的调控 主要是microRNA对mRNA、tRNA 和rRNA的调控,5、翻译后的调控 切除信号肽 糖基化 乙酰化 磷酸化 甲基化 蛋白质的降解,第三节 真核表达系统,组成： 真核表达载体 受体细胞,真核表达载体,适用于在真核细胞中表达外源基因的载体。 真核载体根据受体不同，又可分为几种： 酵母表达载体 哺乳动物细胞表达载体 昆虫杆状病毒表达载体,受体细胞,据受体细胞及表达载体的不同分为3种： 酵母表达系统 哺乳动物细胞表达系统 昆虫细胞表达系统,发酵简单、快速、便宜 真核生物，有翻译后修饰功能 可分泌表达，简化了纯化工艺 受体细胞安全,一、酵母表

11、达系统,（一）酵母载体: 1、概念： 携带外源基因在酵母细胞中复制、扩增 和表达的载体，包括克隆载体和表达载体。 2、组成元件：遗传标记 调控序列,1）遗传标记：用于重组子的筛选和鉴定 营养标记基因：亮氨酸（Leu） 抗生素选择标记基因：Zeocin,2）调控序列 ARS：酵母复制起始区(点) 酵母启动子：常用的有: PGK(磷酸甘油激酶) GAP（3-磷酸甘油醛脱氢酶） ADH1(醇脱氢酶) SUC(蔗糖酶) Apase(碱性磷酸酶) 酵母着丝粒区段(CEN)：增加转化子稳定性,3、类型( types) 酵母克隆载体(yeast clone vector) ：不含酵母启动子，不能在酵母中表达

12、外源基因，如YIP、YRP、YEP 酵母表达载体(yeast expression vector)：酵母克隆载体+酵母启动子,若引入信号肽序列，则成为分泌型载体 酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC) 克隆大片段DNA， 2M质粒：酵母核质中的小的环状DNA，可以独立复制并转录。,（1）酵母克隆载体的构建,酵母整合型质粒( yeast integrated plasmid. Yip) 细菌质粒DNA+酵母遗传标记，通过同源重组整合入酵母染色体，转化子稳定，但转化率极低。 酵母复制型质粒(Yeast replicable plasmid, YRp) 细

13、菌质粒DNA+酵母遗传标记(YIp)+酵母复制序列(ARS),可自主复制，但稳定性差 酵母附加子型质粒, YEp ：细菌质粒DNA+酵母标记基因(YIp)+酵母2M质粒，游离于核外存在并自主复制,酵母复制序列,酵母2M质粒,（2）酵母表达载体,特点：含酵母启动子 穿梭载体(shuttle vector)： 既可以携带外源基因在原核细胞中复制，又可以使其在真核细胞中表达的载体。 种类：啤酒酵母表达载体 毕赤酵母表达载体： 分泌型表达载体 非分泌型表达,啤酒酵母表达载体,毕赤酵母表达载体-整合型,(3) 酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC)-克隆大片段D

14、NA 由下列元件组成 酵母染色体 2umDNA的复制起始区 着丝粒序列（CEN) 四膜虫端粒DNA(TEL),YAC: 利用酵母的着丝粒区段（CEN ）、自动复制序列（ARS）及四膜虫端粒DNA(TEL)构建的人工染色体 结构： 左臂：TEL、选择标记、ARS 、CEN 右臂：TEL、选择标记 特点：容量大（50-1000kb），稳定性差 作用：构建基因组文库,二）受体细胞 1.啤酒酵母： 较早使用，了解清楚 安全性高，被FDA确认为安全生物 表达量较低 过量糖基化 转化子不稳定，易发生质粒丢失,2. 毕赤酵母：新发展的酵母受体细胞 高表达（12g/L） 高稳定-载体为整合型 高分泌（10g/

15、L）,三）转化,1. 原生质体法：去除厚壁 2.电穿孔法：效率较高，整合型载体转化前要酶切线性化 3. LiCl法：做成感受态细胞,四）外源基因在酵母菌中的表达,1、胞内表达：直接表达外源基因， 如：HBsAg的酵母重组疫苗 2、分泌表达：在MCS前加入信号肽序列， pGAPZ,利用因子分泌表达,五）高表达的策略 （1）利用诱导型强启动子：毕赤酵母表达载体中常用启动能力强的GAP启动子 （2）提高整合拷贝数：可利用载体中提供的抗生素遗传标记，以抗生素加压筛选含有多拷贝的转化子。 （3）控制蛋白酶降解活性：采用蛋白酶缺陷型宿主菌，改变发酵培养基的PH值，或在培养基中补加氨基酸或多肽，均可避免产物

16、被降解。 （4）分泌表达：也是一种避免产物被降解的良好策略。,酵母双杂交系统,Yeast Two-Hybrid System,酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过报告基因的表达产物敏感地检测得到。 1989年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述了酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)。蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用对真核基因转录调控影响的实验。,很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA 上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。这种DNA

17、结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA 结合结构域 (Binding Domain, BD)和转录活化结构域 (Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的,这两个结构域各具功能，互不影响, 单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。,基本原理 在利用GAL4 系统筛选cDNA 文库或研究蛋白间的相互作用时，DNA 结合结构域与靶蛋白即“诱饵”相结合，转录活化结构域与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。一般情况下，单独的BD

18、可以与GAL4 上游活化序列（GAL UAS）结合但不能引起转录，单独的AD 则不能与GAL UAS 结合，只有当BD 与AD 分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD 与AD 才能与GAL UAS 结合并且引起报道基因的转录。,已知蛋白X与BD-fusion -诱饵（bait） 未知蛋白Y与AD-fusion -猎物或靶蛋白（prey or target protein） 报告基因（reporter gene） -Lac Z（编码-半乳糖苷酶）,LacZ reporter - Blue/White Screening HIS3 reporter - Screen on

19、 His+ media (usually need to add 3AT to increase selectivity) LEU2 reporter - Screen on Leu+ media ADE2 reporter - Screen on Ade+ media URA3 reporter - Screen on Ura+ media (can do negative selection by adding FOA),报告基因,已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域（BD）融合，构建成诱饵质粒,将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域(AD)融合，构建成文库质粒,将

20、这两个质粒共转化于酵母细胞中,酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录,酵母双杂交系统的优点,高敏感性。 真实性。检测在活细胞内进行，作用条件与作用力无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。 简洁性。融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和纯化蛋白质的繁琐步骤。 广泛性。采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料构建cDNA文库，能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质，适用于部分细胞质、细胞核及膜结合蛋白。,分析已知蛋白之间的相互作用 对蛋白质功能域的分析，如可将待测蛋白质进行点突变或缺失突变再进行双杂交。 用

21、已知功能蛋白质筛选双杂交cDNA文库，研究蛋白质之间相互作用的传递途径，发现新基因。 分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛选文库，再根据筛的已知基因推测新基因功能。 绘制蛋白质相互作用系统图谱 在药物设计中的应用,酵母双杂交系统的应用现状,进行完全的翻译后修饰 可表达产生有功能的膜蛋白 用途：表达大量的外源蛋白 研究基因的功能 基因治疗 两部分： 哺乳动物表达载体 受体：哺乳动物细胞,二、哺乳动物细胞表达系统,1、主要元件 2、载体的类型 非病毒性载体 病毒性载体,一）哺乳动物细胞表达载体,(一）主要元件,1）启动子 病毒来源的： SV40 : 绿猴空泡病毒（Simian vacu

22、olating virus-40） CMV: 巨细胞病毒（Cytomegalovirus ） RSV: 肉瘤病毒（Rous sarcoma virus） ADV: adenovirus （腺病毒） LTR: 逆转录病毒长末端重复序列（Long terminal repeat from retrovirus） 细胞来源的： HSP：heat shock protein（热休克蛋白）,(Promoter + ori),(PolyA),ori,2）增强子 许多来源于病毒的增强子在不同种属细胞中都有极强的促进转录能力 SV40 enhancer RSV enhancer CMV enhancer LT

23、R enhancer,3）筛选标记 胸苷激酶(tk)基因 Thymidine kinase gene 二氢叶酸还原酶(dhfr)基因 Dihydrofolate reductase ,dhfr 新霉素抗性基因 neomycin resistance gene,胸苷激酶(tk)基因,tk+细胞中：胸苷(T) 胸苷一磷酸,二氢叶酸,二氢叶酸还原酶,四氢叶酸,dCTP dATP dTTP,氨基喋呤(Aminopterin),tk,阻断,补加次黄嘌呤（Hypoxanthine）,死亡,存活,Dihydrofolate,Thymidine,（1）,（2）,（3）,HAT,二氢叶酸还原酶基因筛选法原理,携

24、带外源基因的载体连接有dhfr基因，可以表达二氢叶酸还原酶 以dhfr-细胞为受体 :CHO细胞 dhfr-细胞无法在普通培养基中存活，而转化入dhfr基因后可以存活，并表达外源基因。 若在培养基内加入甲氨蝶呤，进行加压筛选，可以提高外源基因表达量,新霉素的类似物G418对原核、真核均有毒 neo编码的酶可使G418灭活 此种筛选方法对受体细胞无要求，应用更简便,新霉素抗性基因(neo),4）转录终止信号和多聚腺苷酸信号 使转录后的mRNA 能有效进行切割和多聚腺苷酸化,多聚腺苷酸信号,5）复制元件： 使载体在受体细胞中复制， 提高外源基因的表达水平 6）原核细胞的部分序列 在原核细胞复制的复

25、制起始为点（ori) 在原核细胞复制筛选的抗生素抗性基因（AMPr）,复制元件,复制元件,1）非病毒性载体 2）病毒性载体：腺病毒，慢病毒等,2、 载体的类型,1）非病毒型 (复制子型, 质粒型） 由真核复制信号、启动子,转录单位及质粒片段组成,不需要包装细胞。 如： pSV系列、pCDNA3等,(二）载体的类型,2）病毒型载体 外源DNA插入病毒DNA或取代病毒基因某一片段，重组DNA随病毒颗粒而复制 (多需辅助病毒或包装细胞的存在)。如：逆转录病毒载体、腺病毒载体等,病毒型载体的类型,整合型 整合入宿主染色体，随染色体复制而复制 可持续表达外援基因 安全性低：插入诱变 SV40载体、逆转录

26、病毒载体、慢病毒载体 游离型 不整合 生物安全性高 瞬时表达 腺病毒载体、痘苗病毒载体,1、CHO细胞（中国仓鼠卵巢癌细胞） -可大规模培养 2、COS细胞（猴肾细胞系）：可合成SV40复制的大T抗原，可使每个细胞中的SV40载体拷贝数多达10万个，适合于大量表达SV40载体上的基因 3、其他动物的细胞： 如Hela细胞（人宫颈癌细胞）、HEK293细胞,二）受体细胞-哺乳动物细胞,三）基因转移技术,转化：将质粒或以质粒为载体构建的重组DNA导入细胞的方法。 1. 磷酸钙共沉淀法 2. DEAE-Dextran 3. 脂质体转染法： 4. 电穿孔法 5. 显微注射法 6. 受体介导的基因转移方法 转染：将病毒或以病毒为载体构建的重组DNA导入细胞的方法,脂质体介导的基因转移,脂质体(Liposome)介导：Lipid/D