实验 大蒜细胞SOD的提取和分离

1、实验五 大蒜细胞SOD的提取和活力测定一、实验原理超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子（O2-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8磷酸缓冲液提取出。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。SOD酶活性测定原理：核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2.，当加入氮蓝四唑（NBT）后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行

2、，使蓝色二甲月替 生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值。二、材料和试剂1提取试剂：（1）. 新鲜蒜瓣（2）. 0.05mol/L/0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）（3）. 氯仿-乙醇混合液：氯仿:无水乙醇=3:5（4）. 丙酮：用前需预冷至4-102测活试剂：（1）0.026 mol/L 蛋氨酸（Met）磷酸钠缓冲液准确称取L-蛋氨酸（C5H11NO2S，MW=149.21）0.3879g于100mL小烧杯中，用少量0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.1 mol/L pH7.8的

3、磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀（现用现配）。4冰箱中保存可用12d。（2）7.5 104 mol/L NBT溶液准确称取NBT（C4OH3OCl2N10O6，MW=817.7）0.1533g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入250mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀（现配现用）。4冰箱中保存可用23d。（3）含1.0mol/L EDTA的2 105 mol/L核黄素溶液A液：准确称取EDTA（MW=292）0.00292g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。B液：准确称取核黄素（MW=376.36）0.0753g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。C液：合并A液和B液，移

4、入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，此溶液为含0.1mmol/L EDTA的2mmol/L 核黄素溶液。4冰箱中保存可用810d。该溶液应避光保存，即用黑纸将装有该液的棕色瓶包好，置于4冰箱中保存。当测定SOD酶活时，将C液稀释100倍，即为含1.0mol/L EDTA的2 105 mol/L 核黄素溶液。三、实验步骤1、组织细胞破碎：称取10g大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨。2、SOD的提取：破碎后的组织中加入4倍体积（40ml）的0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8），继续研磨15min，使SOD充分溶解到缓冲液中，取一半体积于800010000rpm下离心10min，另一半55-60

5、热处理15 min后离心，取上清液，分别记录体积并留样1.5ml。3、除杂蛋白：上清液加入0.25体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min，5000rpm离心15min，得到的上清液为粗酶液。4、SOD的沉淀分离：粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，800010000rpm离心10min，得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）中（溶解时，住ml加入），未经加热变性的样品于55-60热处理15 min，得到SOD酶液。5、SOD活力测定每个处理取5个洗净干燥好的微烧杯/玻璃试管编号，按表1加入各试剂及酶液，反应系统总体积为3mL。其中4，5号中磷酸钠缓冲液量

6、和酶液量可根据试验材料中酶液浓度及酶活力进行调整（4号为Pi粗提酶，5号为丙酮沉淀）。各试剂全部加入后，充分混匀，取1号微烧杯置于暗处，作为空白对照，比色时调零用。其余4个微烧杯均放在温度为25，光强为4 500Lux的光照箱内（安装有3根20W的日光灯管）照光15min，然后立即遮光终止反应。在560nm波长下以1号杯液调零，测定各杯液光密度并记录结果。以2、3号杯液光密度的平均值作为抑制NBT光还原率100，对照测出其他酶液的光密度值。表1 反应系统中各试剂及酶液的加入量（mL） 试 剂杯 号磷酸钠缓冲液蛋氨酸（Met）NBT溶液酶 液核黄素10.91.50.300.320.91.50.300.330.91.50.300.34（粗提酶）0.21.50.30.70.350.21.50.30.70.3结果计算1560nm波长下各杯液的光密度（表2）表2 测定数据列表杯 号123452、3号平均值酶液量（mL）0000.70.7光密度（OD560nm）02.SOD酶活力按下式计算：SOD的活性单位以抑制NBT光还原的50%为一个活力单位，按下式计算SOD活性：A(D1D2) V D1 B W 50式中各因子代表内容如下：A：为酶活力（酶活力单位：U/g）；V：为酶提取液总体积（mL）