第七章-分子发光分析法.ppt

1、第七章 分子发光分析法,本章教学内容： 7.1 概述 7.2 分子荧光分析法 7.3 分子磷光分析法 7.4 化学发光分析法 7.5 实验技术 7.6 应用,1,7.1 概述,2,有些物质受到光照射时，会吸收特定波长的光，即会吸收光谱，除此之外，还会发射出比原来吸收波长更长的光。当激发光停止照射后，这种光若随之很快消失，叫荧光；若激发光停止后仍可持续发光一段时间，叫磷光。荧光和磷光都属于光致发光。 还有电致发光、化学发光、生物发光等。 由于物质分子结构不同，所吸收光的波长及发射的荧光波长也不同。利用物质的荧光谱线位置的不同可以定性鉴别物质；同种物质的浓度不同，所发射的荧光强度不同，利用这个性质

2、可以定量分析。这种分析法叫荧光分析法。,荧光法最主要的优点之一是灵敏度高。紫外吸收法的灵敏度为10-7 g/mL，而荧光法可达10-10 10-12 g/mL。 对于有机化合物，荧光法的选择性高于紫外吸收法。 因此，荧光法在生物化学、环境科学、医药学、食品分析、卫生检验、农林牧产品分析和科研领域中具有特殊的重要性。 分类,根据激发光波长范围,根据待测物质的存在形式,X射线荧光分析法 紫外-可见荧光分析法 红外荧光分析法,分子荧光法 原子荧光法,本章主要介绍分子的紫外-可见荧光。,7.2.1 分子光谱的产生-电子自旋的多重性,多重性（multiplicy, M）：电子自旋的状态 单重态(sing

3、let state, S)：分子中所有电子自旋都相反配对的电子态(M=1) 三重态(triplet state, T)：分子中电子对的电子自旋平行的电子态(M=3),7.2 分子荧光分析法,5,S0 S1 T1 M=1 M=1 M=3 S-电子的总自旋量子数,对同一物质，物质所处的多重态不同，性质明显不同 S态磁场中不分裂，抗磁性；T态分子磁场中分裂，顺磁性; 2 电子在不同的（单、多重）态间跃迁需换向，不易发生;,3 各状态能量高低： S2T2S1T1S0 4 S0T1跃迁禁阻，但是S1 和T1发生互换后，T1 S0跃迁可产生磷光；,Jablonski 能级图,6,1. 振动驰豫 (vibr

4、ational level relaxation, VR),Jablonski 能级图,2. 内转换(internal conversion, IC),7. 外转换(external conversion, EC),分子的去激发过程 （绿色虚线）,4. 系间窜跃(intersystem crossing, ISC) （黑色虚线）,7,5. 分子荧光 (vibrational level relaxation, VR),Jablonski 能级图,6. 延迟荧光(prompt fluorescence),7. 分子磷光(delayed fluorescence, DF ),分子的去激发过程,8,

5、1 荧光激发光谱固定发射波长em ，扫描激发波长ex而获得的荧光强度If -激发波长的关系曲线；反应了不同激发波长激发荧光的相对效率；,7.2.2 分子荧光的性质,Ifex,2 荧光发射光谱固定激发波长em ，扫描发射波长em而获得的荧光强度If -发射波长的关系曲线；反应了不同发射波长激发荧光的相对效率；,Ifem,本质：吸收光谱,本质：荧光发射光谱,Ifex和Ifem可组成两维光谱，用于选择条件。,9,a) 单色器改变em，同一荧光物质Ifex曲线形状不变，只是灵敏度有变化，即曲线高低变化；b) 理论上，ex(max)和 abs (max) 相等，激发光谱和吸收光谱相同；,a) 荧光光谱的

6、形状(Ifem曲线)和激发波长ex无关， b) 分子荧光的em总比其相应的ex长，这种波长的位移表明荧光激发和发射之间的能量损失，称为Stokes位移；c) 荧光光谱和吸收光谱有镜像关系(mirror image),荧光激发光谱特点：,荧光（发射）光谱特点:,10,7.2.3 分子荧光的参数,1 荧光寿命 (fluorescence lifetime),2 荧光量子产率 f(quantum efficiency),反映了荧光物质发射荧光的能力；,处于激发态的荧光体返回基态之前停留在激发态的平均时间，用表示；激发态分子数目衰减到原来的1/e时所经历的时间。 当 t=, 有63激发态分子去激 实验

7、测定：ln(I0/It)t作回归曲线， 斜率1/ 便可求出,11,1 荧光强度与浓度,荧光分析是微量组分或痕量组分分析方法，当浓度增至吸光度 A 0.05，产生浓度效应和自吸效应，If与c的关系偏离线性！,7.2.4 荧光强度的主要影响因素,荧光强度的影响因素,12,什么分子产生荧光？ 强荧光分子都具有大的共轭键以及供 电子取代基和刚性平面结构，什么分子不产生荧光？ 饱和化合物与只有孤立双键的化合物,2 荧光与分子结构,荧光强度的影响因素,13,（1）共轭键体系 荧光最强，环越大，发光越强，发光峰红移程度越大 共轭环数相同的芳香族化合物，线性环结构的荧光波长比非线性长,14,短 长,（2）刚性

8、平面结构 i) 强荧光分子多具有刚性平面结构：减少自身的振动，与溶剂分子或其他溶质的作用减少，较少碰撞几率；,ii) 很多同分异构体的反式具有平面结构，通常为荧光物质，而顺式非平面结构不发荧光。,15,f-荧光量子产率 0f1,（3）取代基效应 供电子取代基使荧光加强 基团：NH2，NHR，NR2，OH，OR，CN等 n电子云与芳环上的电子轨道平行，形成了p 共轭，扩大共轭体系。但是基团中的n电子转化为共盐后，它们的荧光均大为减弱。,16,吸电子取代基使荧光减弱，磷光增强 基团：COOH，CO，NO2，SH及重氮基等。 n电子云并不与芳环上的电子云共平面，不能构成 p共轭，荧光发射弱； 重原子

9、效应：而芳环上取代卤素后系间窜跃较为强烈，相应荧光随卤数原子量的增加而减弱，磷光相应增强。,17,（4）电子跃迁类型 含O、N、S等杂原子的有机物如喹啉和芳酮类化合物含有非键电子n，电子跃迁多为n*型，系间窜跃强，荧光很弱或不发荧光； 不含含O、N、S原子的有机体多发生 *类型跃迁，荧光辐射强！,基态荧光分子M和猝灭剂Q反应生成非荧光物质MQ,荧光强度的影响因素,18,常见的猝灭类型 （1） 自猝灭： 荧光物质分子M*和它的基态M碰撞引起猝灭； 荧光物质的自吸收，S1激发态的分子发射的荧光被处于基态M的分子所吸收，使荧光强度降低。 荧光物质分子的缔合。某些荧光体分子处于基态时会形成二聚体或多聚

10、体，或者激发态分子S1与基态分子M形成激发态二聚体1(M*M)。,（2）电荷转移猝灭： 激发态分子发生氧化还原反应,19,（3） 转入三重态猝灭 经系间窜跃进入三重态的分子，多余的能量消耗在碰撞之中使荧光猝灭。 溴化物和碘化物由“重原子效应” ，促使荧光分子的激发单重态转入激发三 重态，导致荧光的猝灭； 氧分子也会增强使荧光物质系间窜跃，氧分子是荧光最常见的 猝灭剂。,（4） 光化学反应猝灭 某些光敏物质在紫外或可见光的照射下易发生化学反应或预离解跃迁； DNA、多糖类和蛋白质等物质在UV和VIS下可引起光解作用。,20,4. 温度、酸度、溶剂和表面活性剂的影响,荧光强度的影响因素,温度对于溶

11、液的荧光强度有着显著的影响。 温度降低，分子运动速度变慢，从而使荧光和磷光分子与溶剂分子 或其它分了的碰撞机率减小，f 和 If 都增大,特别是对于分子磷光，室温下很难观 察到磷光，一般分子磷光都是在低温 下测定！,21,pH值改变会影响弱酸或弱碱的型体分布，进而影响荧光强度； 在荧光分析中一般都要较严格地控制溶液的pH值:,溶剂的极性改变也会使荧光物质 的f发生变化； 荧光探针 （fluorescence probe）对溶液极性敏感。,表面活性剂的影响 表面活性剂的浓度增大到CMC时，单体缔结成胶束，保护荧光质 点，减小猝灭，使f增大，荧光增强。 CMC-临界胶束浓度,22,7.2.5 荧光

12、定量分析法,（1）工作曲线法 将标准物质配成一系列标准溶液c并测定它们的相对荧光强度If，以 If 对c进行线性回归得到工作曲线。,（2）比较法 纯物质：cs、Ifs、If0 试液： cx、Ifx,23,（3）荧光猝灭法 对于静态猝灭：,对于一定浓度的荧光物质，配制加入一系列不同量的猝灭剂Q，I0f /If 对cQ进行线性回归得到工作曲线. (Q cQ),当cQ（猝灭剂的总浓度） cM（荧光物质总浓度）时，上式成立。,24,I0f -猝灭剂加入后试剂的荧光强度； If -猝灭剂加入前试剂的荧光强度；,（4）多组分混合物荧光分析法,a) 混合物中各组分的荧光峰互不干扰，可在各自波长下测量，和单组

13、分的测定相同；,b) 混合物中荧光峰相互干扰，激发光谱显著不同，可以选择不同的激发光进行测定；,25,c) 同一激发波长荧光光谱互相干扰，利用荧光强度的加和性，建立联立方程且求解： If 435/385 , If 480/385-混合液在435和480nm出的荧光强度（测定）； K -各纯物质的相对摩尔荧光强度（测定）； CT CP -硫胺素和吡啶硫胺素的浓度（求出）。 利用工作站的软件,26,（5）荧光分析注意事项,荧光分析是微痕量分析技术，对溶液、工作条件和环境特别敏感： 防止荧光污染 干扰：器皿、溶剂、洗衣粉、洗液、手上的油脂、细菌等 解决：用蒸馏水洗净后再使用，溶液新鲜配制并除氧 防止

14、散射光的干扰 干扰：丁铎尔散射、瑞利散射和拉曼散射 解决：选择合适的测定波长或滤光片,27,上海CRT 970,HITACHI（日立）F-4500,美国PE公司 LS50B,天津WGY-10,7.2.6 荧光分光光度计,28,（2）单色器：滤光片和光栅 应用最多的是光栅单色器。一块为激发单色器，用于选择激发光的波长，另一块为发射单色器，用于选择荧光发射波长。 荧光的测量通常在与激发光垂直的方向上进行（消除透射光和散射光对荧光测量的影响）。,29,（3）样品池：四面透光的的方形石英池,（4）检测器：光电倍增管和电荷偶合元件检测器,2 仪器灵敏度Sa,Sa= f f：量子产率， ：摩尔吸光系数 实

15、际测定0.05M H2SO4介质中硫酸奎宁的最低浓度为Sa指标， 其值在1.0 10-101.0 10-12 g/mL 水的拉曼峰高（S）和仪器的噪声值（N）的比值S/N为指标，其值在20200之间。,30,荧光分析法的特点： 灵敏度高 荧光分析法的灵敏度比吸光分析法高24个数量级，检测限在0.10.001gmL1之间； 选择性好 荧光分析法的光谱特征性强，而且有激发光谱和发射光谱。如果某几种物质的激发光谱相似，就可以从它们发射光谱的差异进行鉴别和分析；相反如果发射光谱相似，可以从它们激发光谱的差异进行鉴别和分析； 荧光法提供比较多的物理参数 激发光谱、发射光谱和三维光谱以及荧光强度、荧光效率

16、、荧光寿命等多种物理参数。这些参数反映了分子的各种特性，能从不同角度提供研究对象的分子的信息；,荧光分析法的缺点： 应用还不够广泛，这是因为本身能发射荧光的物质相对较少。此外，荧光分析的灵敏度虽高，测定时对环境因素较为敏感，干扰因素较多。,31,7.2.7 分子荧光分析法的应用,无机化合物的分析 待测元素与有机试剂生成具有荧光特性的配合物，约70多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土 采用直接荧光分析法测定； 氟、硫、铁、银、钴、镍 采用荧光猝灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇、过氧化氢 采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲 采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀 采用固体荧光法测定,32,(

17、2) 有机化合物的荧光分析,33,(3) 溶液中单分子行为的研究,分子荧光法利用激光诱导产生超高灵敏度（激光诱导荧光），可以用来 观测溶液中某些物质的单分子的行为； 目前，利用激光诱导荧光技术，已经观察到罗丹明6G分子、荧光素分子 和DNA分子等单分子行为。,(4) 基因研究及检测,DNA自身荧光效率很低，利用某些荧光分子作为探针，通过探针标记分子 的荧光变化来研究DNA与小分子及药物的作用机理，探讨致病原因及筛选 药物！,34,常规的荧光分析法是分别固定荧光ex和em下，扫描荧光发射光谱和激发光谱。 同步荧光法 是同时扫描激发光和发射光波长下绘制的光谱，由测定的荧光强度信号与对应 的激发波长

18、（或发射波长）构成光谱图。 通常把在扫描过程中使激发波长（ex）和发射波长（ em）保持固定的波长间 隔（即ex em 常数），这种方法称为固定波长同步荧光测定法，是最早提 出的同步扫描技术。,优点： 光谱简单、光谱窄化、减少光谱重叠、减少散射光影响、提高选择性等,35,2. 导数荧光测定法 导数荧光测定法的基本原理与分光光度法类似。导数技术引入荧光分析，解决了荧光测定中的背景干扰和谱带重叠问题，可以提高荧光分析选择性。 7. 三维荧光光谱测定法 描述荧光强度（If）同时随激发波长（ex ）和发射波长（em）变化的关系图谱，称为三维荧光光谱。 表示方法：一 等角三维投影图 坐标轴分别表示发射波

19、长、激发波长和荧光强度 二 等高线光谱图 平面上的点表示由两波长所决定的样品的荧光强度,36,7.3 分子磷光分析法,（1） 磷光的产生 分子从亚稳态T1的最低振动能级跃迁返回S0态发出的光,（2） 磷光分析 低温磷光分析：磷光在室温下易猝灭，将试样溶于有机溶剂中，在液氮（77K，273 C）中形成刚性玻璃状物质，再测量磷光。 低温可减少分子间碰撞，防止磷光猝灭； 溶剂易于提纯和制备，能溶解被分析物质 77K时溶剂能形成刚性状玻璃体,37,（3） 磷光分析仪 磷光分析仪器与荧光分析仪器同样由五个基本部件组成，但需要有一些特殊的配件，在比较好的荧光分析仪器上都配有磷光分析的配件，因此两种方法可以

20、用同一仪器。 磷光分析仪器与磷光分析仪器的主要区别有两点。,I. 样品池需配有冷却装置 对于溶液磷光的测定，常采用低温磷光分析法，即试样溶液需要低温冷冻。 通常把试液装入内径约1-3mm的石英细管（液池）中，然后将液池插入盛有液氮的石英杜瓦瓶内，如图所示.,38,II. 磷光镜 有些物质会同时发射荧光和磷光，因此在测定磷光时，必须把荧光分离去。可利用磷光寿命比荧光长的特点，在激发单色器和液池之间装一个磷光镜。,39,转动的两斩波片： 同相时-测定的是荧光和磷光的总强度； 异相时-测定的是磷光强度（因荧光寿命短）。 斩波片,（4） 磷光分析法的应用 磷光分析法主要用于有机化合物的测定，如稠环芳烃

21、和氨基甲酸酯类农药、可待因等许多生物碱和萘乙酸等植物生长激素。 此外磷光分析技术也已应用于生物活性物质的测定，如色氨酸、酪氨酸和研究蛋白质的结构。,40,在化学反应过程中，某些化合物接受化学反应能后被激发，从激发态跃迁回基态时产生的光辐射称为化学发光(chemiluminescence, CL)。 A + B = C * + D C * C + h,7.4 化学发光分析,（1）化学反应提供足够的化学能被发光物质吸收形成电子激发态，多是有H2O2、O3等参加的高能氧化反应； （2）发光持续时间较长，反应持续进行； 存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，有酶参与的化学发光反应称生物发光(biol

22、uminescence)。,41,化学发光效率CL ，又称为化学发光的总量子产率，它决定于生成激发态分子的产率Cex和发光效率em ，CL 通常较低，一般不超过1,7.4.1 化学发光效率与定量关系式,化学发光的相对强度Icl(t)与化学发光反应的速率关系：,42,7.4.2 化学发光分析类型,（1） 液相化学发光,鲁米诺(Luminol)体系：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰环肼）也称冷光剂，在碱 性介质中与H2O2等氧化剂反应，可产生最大发射波长为425 nm的光，,可测痕量的H2O2 、Cu2、Mn2、Co3+、V5+、Fe3+、Cr3+等金属离子。 化学发光反应效率CL：1,43,光泽精(lucigenin)体系： 光泽精（N, N-二甲基-9, 9-联吖啶二硝酸盐)，在碱性溶液中与H2O2反应生成激发态的N-甲基吖啶酮，可产生最大发射波长