随机扩增多态性DNA标记技术

1、随机扩增多态性DNA标记技术参考周延清2005.生物实验室系列-DNA分子标记技术在植物研究中的应用. 北京化学工业出版社P79-130一、 引言随机扩增多态性DNA标记技术,检测出核酸碱基序列的变异，并且将这种变异以遗传标记的方式予以应用，使植物遗传学许多方面的研究产生了革命性的变化。最早检测到的DNA水平的变化是限制性片段长度多态性（RFLP）。但是，在过去一段时间，聚合酶链反应（Polymerase chain reaction, PCR）极大的影响了分子生物学几乎所有领域，而且基本程序被改进后，可以开发出多种检测核苷酸水平差异的方法。不过，这些方法大多需要预先知道DNA片段序列的一些信

2、息，以便根据已知的信息设计合成目的的DNA序列两端的引物，通过PCR选择性地扩增目的的DNA。1990年，Williams等发表了一种检测核苷酸序列多态性的新方法，这种方法以PCR为基础，可不必预先知道DNA序列的信息。随后，随机扩增多态性DNA技术（randomly amplified polymorphic DNA,RAPD）广泛地应用于植物和其它领域的研究中。RAPD标记技术由于操作简便、快速、省时、省力、DNA用量少，迅速受到人们重视，并在农、林、医及植物和微生物学的各个领域中得到广泛应用，在基因定位与分离、连锁和系统演化等各方面取得了很大的进展。二、 RAPD标记技术的概念和原理任何

3、生物种都具有特定顺序和结构的遗传物质-DNA。由于在生物进化过程中选择性的不同。生物基因组DNA的不同区域表现出高度保守或高度变异的现象，具有不同的遗传多样性。随机扩增多态性DNA（RAPD）标记技术是通过分析遗传物质DNA经过PCR扩增的多态性来诊断生物体内在基因排布与外在性状表现的规律的技术，由于片段被引物选择性地扩增，扩增了的片段能在凝胶上清晰地显现出来，这样就可以通过同种引物扩 条带的多态性反映出模板的多态性，RAPD只需要一个引物，长度为10个核苷酸左右，引物顺序是随机的，因而可以在对被检测对象无任何分子生物学资料的情况下对其基因组进行分析。单引物扩增是通过一个引物在两条DNA互补链

4、上的随机配对来实现的，但基因组DNA分子内可能存在或长或短的被间隔开的颠倒重复序列，那么在两条单链上就各有一个引物结合部位，构成单引物PCR扩增的模板分子。如果引物的核苷酸序列很短，退火温度又很低，引物与DNA模板颠倒重复序列的机会就会增多，产生若干单引物PCR扩增产物，形成该引物的特异图谱。不同DNA中的这种颠倒重复序列数目及间隔长短的不同，扩增的条带就不同，即出现多态性。当引物较短时，很多在染色体上相邻且方向相反的引物位点存在于基因组内（图4-1）PCR技术扫描含有这些颠倒重复序列的基因组，而且扩增不同长度的插入DNA片段。实际上由于PCR扩增技术的限制，长度在200-2200bp的片段能

5、够扩增出，在这范围以外的片段不能扩增。三、 RAPD标记技术的特点作为PCR技术的延伸，RAPD反应有其自身的特点。这也是RAPD标记技术一诞生就被广泛接受和使用的原因所在。（一） RAPD标记技术的优点 无需专门设计RAPD扩增反应的引物，随机设计的长度为9-10个碱基的脱氧核糖核苷酸序列均可应用。但是为了保证退火反应时双链的稳定性，G+C含量应在40%以上。而常规的PCR反应必须通过已知的序列设计特定的引物，在每一个RAPD反应中只加入一个引物。通常一种引物在两条DNA互补链上的随机配对实现扩增。 PCR引物没有种属限制，一套RAPD引物可以应用于任意一种生物的研究，具有广泛和通用性的特点

6、。 在最初的反应周期中，退火温度较低，一般为36。一方面保证短核链引物与模板的稳定配对，另一方面允许适当的错误配对，从而扩大引物在基因组DNA中配对的随机性，提高对基因组DNA进行多态性分析的效率。 不需DNA探针，设计引物也无需预先知道序列信息。 显性遗传（极少数为共显性遗传），不能鉴别杂合子和纯合子。 操作技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影技术。省工、省力，工作效率高。 DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本低。 不受环境、发育、数量性状遗传的影响，能够客观地提示供试材料之间DNA的差异，因而成为一种理想和有效的分子生物学的技术。 RAPD产物经克隆和序列分析后，可作为RFLP和原位杂

7、交的探针，也能够转变成为利用经典PCR技术的分子标记，诸如序列标记位点（STS）、序列特征化扩增区域（SCAR）等。（二） RAPD标记技术的缺点 发生一次或几次突变时引物就不能和引物位点匹配的假设未必成立，不匹配可能只发生在二次突变或者多次突变的时候。 该技术用于二倍体材料时，区别纯合子和杂合子的统计分析会有难度。 在某些情况下，实验结果不能重复，结果可靠性较低。然而能否重复也取决于实验条件，细致工作可以提高重复的可能性。 该技术使用的效果因生物种类而定。在细菌中，因其是单倍体又是无性繁殖，所以，RAPD标记技术很有用。四、 RAPD标记技术操作五、 RAPD标记技术转化为SCAR标记技术六

8、、 RAPD标记技术的应用(一) 遗传图谱的构建(二) 系统进化发育与以前的形态分析和同工酶分析相比,RAPD标记技术具有灵敏度、简便、信息量大和对材料要求不高等优点。因此，该技术为物种分类和系统演化方面的研究提供了一种可靠、快速的研究手段。作物亲缘关系鉴定与研究能够为杂交亲本的选配提供依据，能够有效地预测杂种优势，能够确定不同作物品种之间亲缘关系及其进化地位，有选择的利用其某些优良农艺性状改良作物。所以，作物育种研究人员目前已经利用RAPD标记技术对杨树、水稻、大麦等作物进行了分类鉴定和系统进化分析。亲子鉴定。RAPD标记技术适合种内、种间、甚至近缘属间亲缘关系研究(三) 基因定位RAPD技

9、术既能对整个基因组进行多态性检测，又能迅速定位某些抗病等重要性状基因。利用RAPD标记技术进行基因定位，根据样品来源不同有如下两种方法：首先，近等位基因系（near isogenic lines,NILs）的基因定位，所谓NILs是由提供目标基因的供体亲本同轮回亲本杂交，并多次回交，经每代对目标基因选择而获得的，除目标基因外其余性状大部分都同轮回亲本相同的品系。因此，其基因组DNA除目标基因所在区域同轮回亲本不同外，其余部分则基本相同。这样就可用RAPD标记技术对这两个基因组轮回亲本和近等位基因系DNA进行多态性检测，找出两个基因组扩增产物的差异，以这些差异产物为标记，经RFLP分析即可定位此

10、基因。其次还有Michelmore提出的分离群体分组分析法（bulked segregation analysis,BSA）。(四) 植物分子标记辅助选择育种分子标记用于辅助选择育种可提高选择的准确性和效率，缩短育种年限。RAPD标记技术用于辅助选择育种已经取得了很大的进展，定位了许多有价值的目标性状基因，为简单方便的鉴定和筛选抗病虫基因提供了一种分子水平的新方法。在辅助选择育种中，RAPD标记对质量性状进行标记的主要策略是近等基因系和混合群体分离法，对数量性状基因进行标记主要采用QTL作图法。1 抗线虫基因Rkn-mn1的RAPD标记该基因主要存在于野生种中（为显性基因），可通过种间杂交渗入

11、栽培种中Barloy等通过作图定位了3个与该基因连锁的RAPD标记，可通过标记辅助选择把Rkn-mn1基因引入到栽培种中。2 抗病基因的RAPD标记3 雄性不育性状的RAPD标记4 在耐盐碱性状标记方面的应用植物耐盐碱性状是由多个核基因控制的，而且胞质基因也起着重要作用。寻找耐盐碱基因紧密连锁的RAPD标记。(五) 外源染色体（片段）的鉴定与标记(六) 遗传多样性、亲缘关系和品种鉴定的研究(七) 体细胞杂种的鉴定(八) 性别鉴定第二节 任意引物PCR标记技术一 引言1990年,在Williams等发表随机扩增多态性DNA标记技术的同时,Welsh等发表任意引物PCR(arbitary prim

12、r PCR,AP-PCR);1991年,Caetano-Anolles等发明的DNA扩增指纹(DNA amplification fingerprinting,DAF).这三种技术都用任意引物随机扩增，彼此相似，只是它们所用引物的长度不同而已。当然这三种技术中RAPD应用最为广泛。RAPD标记技术使用10个碱基的寡核苷酸片段作单引物随机扩增基因组DNA；AP-PCR标记技术使用20bp碱基的任意引物或30bp碱基的任意引物随机扩增基因组DNA；DAF利用5个或者8个碱基的寡核苷酸片段作单引物随机扩增基因组DNA。它们有相似的地方，也有各自的特殊性。本节将对AP-PCR标记技术进行介绍。二 AP

13、-PCR标记技术的概念和原理Welsh等于1990年用20bp碱基的任意引物或30bp碱基的任意引物随机扩增基因组DNA，发表了任意引物PCR技术。该技术是一项检测DNA片段长度多态性的快速、经济、有效的技术。选择的任意引物最好为标准的引物，以便于不同实验室之间的比较。推荐使用的标准引物如下： 通用M13-20测序引物：TTATGTAAAACGACGGCCAGT M13逆转录测序引物：GGAAACAGCTATGACCATG T7测序引物：GTAATACGACTCACTATAG T3测序引物：GCAATTAACCCTCACTAAAG KpnR引物：CCAAGTCGACATGGCACRTGTATA

14、CATAYGTAAC Alu278引物：GTAAGACTCTG三 AP-PCR标记技术的特点1PCR产物的多态性符合孟德尔定律2同源片段数目与样品之间的亲缘关系成正相关3方法快速、经济、简便。四 AP-PCR标记技术的操作步骤取材（取桑属各代表种，或根据研究目的取材）基因组DNA的提取PCR反应液1TaqPCR缓冲液，1.5mmol/L四种dNTP各200mol/L2.0mol/L引物TaqDNA聚合酶2.5U0.8-1.0gDNA模板终体积50l,混匀后加入50l石蜡油PCR所用引物有有三个:a. M13正向引物(5CGCCAGGGTTTTCCCAGTCA3)b. M13反向引物(5AGCG

15、GATAACAATTTCACACAGGA3)c. )Gal-K引物(5TACGGTGGCGGAGCGCAGCA3)按下述参数进行2个不严格PCR循环:94、5min;35、5min;72、5min. 按下述参数进行40个循环：94、1min;50、1min;72、2min. 72、7min1个循环; 用3%（质量浓度）的琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，然后进行放射性自显影。四 AP-PCR标记技术的应用主要应用于品种鉴定附PCR技术及其影响因素DNA分子标记技术中，RAPD、ISSR和SSR等标记技术都是基于PCR技术。因此，在此对PCR技术及其影响因素作一介绍。DNA聚合酶链式反应（polyme

16、rase chain reaction,PCR）是一种体外扩增某一特定DNA片段（基因）的方法，如果已知某一待研究的DNA片段两端的DNA序列，那么就可以按照已知序列设计两段寡聚核苷酸引物，用引物扩增含有目的的序列的DNA片段。一、 PCR原理PCR是由数十次循环完成的,每个循环包括下列三个步骤.第一,DNA模板变性第二,引物与模板中同源的DNA序列形成双链(退火)第三,在DNA聚合酶的作用下,此引物以底物中的DNA为模板进行延伸.在第二个循环中产生只含有目的DNA的单链,第三个循环中,产生只含有目的DNA双链,通过数十次变性、退火、延伸的循环，在两个引物之间的这段DNA片段就会被大量扩增，理

17、论上讲，经过30次循环以后，这段DNA片段的拷贝数至少可达106-107，最后将这些DNA片段提纯便可进行内切酶反应及其片段分析了。PCR虽然步骤简单，但也有不少局限性。首先需要已知被研究的DNA片段两端的碱基序列；第二，已知的碱基序列应该是高度保守的序列，否则，就不能保证每个个体的PCR产物都是那段特定DNA，因为PCR是一个良灵敏的反应，只要模板中有与引物同源的序列，这段DNA就能被扩增，若以核DNA作为反应模板，PCR产物往往有好几条不同大小的DNA片段，这里便需将目的的片段从琼脂糖凝胶中分离提纯。因此，在操作时一定要注意重复。二、 PCR基本条件及其影响因素1 PCR基本条件PCR必须

18、具备下述基本条件： 模板核酸（DNA或RNA） 人工合成的寡核苷酸引物 合适的缓冲体系 Mg2+ 三磷酸脱氧核苷酸 耐热DNA聚合酶 温度循环参数（变性、复性、延伸的温度和时间以及循环数） 一些其它因素，如二甲基亚砜、甘油、石蜡油、明胶或小牛血清蛋白等也影响某些特定的PCR2 PCR的影响因素上述因素是PCR反应所必须的因素。同时，也是PCR反应的重要影响因素。（1） 模板核酸PCR以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增。不过RNA的扩增需要首先逆转录为cDNA后才能进行正常的PCR循环。核酸标本来源广泛，可以从动植物细胞组织器官、纯培养的细胞或微生物中提取，也可以从临床标本、犯罪现场取样，

19、无论样品来源如何，待扩增核酸都需要纯化，使核酸标本中不含DNA聚合酶抑制剂。PCR反应中模板的加入量一般为102-105拷贝的靶序列。（1g人基因组DNA、10ng酵母DNA和1ng大肠杆菌DNA的量均相当于3105拷贝的靶分子）。因此扩增不同拷贝数的靶序列时，加入的含靶序列的DNA量亦不同。如真核核糖体RNA基因有200-500拷贝，反应中仅需加入0.2-2ng人基因组DNA即可.以质粒DNA或染色体DNA为模板时的扩增最适条件是不同的.,前者需要的酶量少,循环数少,温度不如染色体DNA要求严格.扩增染色体DNA时,至少需要25-50个循环,如果在15个循环后补加一定量的DNA聚合酶,会得到

20、更加理想的效果.扩增靶序列长度根据不同目的而不同.用于检测目的的扩增片段长度一般为500bp以内,以100-300bp为最好.用DNA聚合酶,在较长的延伸时间的条件下,可扩增长达10-20kb的片段.（2） 引物PCR扩增产物的大小是由特定引物限定的.因此引物的设计与合成对PCR的成功与否有着重要作用. 引物合成的质量合成的引物必须经聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高压液相层析(HPLC)z纯化.因为合成的引物中会有相当数量的”错误序列”,其中包括不完整的序列和脱嘌呤产物以及可检测到的碱基修饰的完整链和高分子量产物.这些序列可导致非特异扩增和信号强度的降低.因此PCR所用引物质量要高,且需要纯化.冻干

21、引物于-20至少保存12-24个月,液体状态引物于-20可保存6个月,引物不用时应存于-20保存. 引物设计原则遵循一些简单的规则有助于设计PCR引物,通过微机的帮助更有利于PCR的成功.PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列,PCR引物设计的原则如下:长度:一般为20-27bp,不能大于38G+C含量:40-60%(Tm值即50%双链DNA解开时的温度);有效启动温度一般高于Tm值5-10.依照Tm=4(G+C)+2(A+T)计算, Tm=最好为接近72,使复性条件最好.四种碱基分布随机,不要有聚嘌呤或者嘧啶的存在.尤其3不能超过3个连续的G或C,因为

22、这样会使引物在G+C富集序列区错误引发.引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构或者本复性,影响引物与模板的复性结合,若用人工判断,引物自身连续互补碱基不能大于3bp.引物之间,两引物之间不应有互补性,尤其避免3的互补重叠以防引物二聚体的形成,一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性.引物的3不能进行任何修饰,也不能形成任何二聚体.除了在AP-PCR反应中,引物3不能发生错配.引物的5限制着PCR产物的长度,对扩增的特异性影响不大,因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性.引物的5可以加酶切位点,标记生物素,引入突变和启动子等.引物与非特异性扩增工不能超过70%或者连续8个互

23、补碱基同源.避开产物的二级结构区,有些引物的无效主要是因为引物重复区DNA二级结构的影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域. 引物的用量及其计算.一般PCR反应中引物的终浓度为0.2-1mol/L,在此范围内,PCR产物量基本相同.但引物低于0.2mol/L时,则产物量下降.引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成,还会增加引物二聚体的形成.非特异性产物和引物二聚体也是PCR反应的底物,与靶序列竞争DNA聚合酶和dNTP底物,从而使靶序列的扩增量降低.引物浓度的计算方法:摩尔猝灭系数(EM)是1cm光程比色杯中测定1mol/L寡核苷酸溶液在UV260nm下的光密度(OD)值. EM可按

24、下式计算:EM=a16000+b12000+c7000+d9600式中a,b,c,d分别代表A,G,C,T个数.(例如,一纯化的20mer寡核苷酸溶于0.1ml水中,取10l稀释至1.0ml,测其OD值=0.76.原液的OD为0.76100=76.若此寡核苷酸碱基组成为A,G,C,T的值均为5,其(EM为)(EM =516000+512000+57000+59600=因此,原液中寡核苷酸的摩尔浓度为76/=3.410-4mol/L=340nmol/L 引物（3） 缓冲液目前最为常用的缓冲液为10-50mmol/L Tris-HCl(pH8.3-8.8,20),Tris是一种双极性离子缓冲液.2

25、0时其pK值为8.3。pKa值为-0.021。因此，20mmol/L Tris-HCl(pH8.3-8.8,20)在实际PCR中其pH变化于6.8-7.8之间。改变反应液的缓冲能力，如将Tris浓度加大到50mmol/L （pH8.9)，有时会增加产量。反应混合液中50mmol/L以内的KCl有利于引物的退火，50mmol/L KCl或50mmol/L以上的KCl则抑制TaqDNA聚合酶的活性。有些反应液中以NH4+替代K+其浓度为16.6mmol/L。反应中加入小牛血清蛋白（100ug/ml或明胶0.01%,质量浓度）或Tween20(0.05%-0.1%,体积分数，有助于酶的稳定，反应中加

26、入5mmol/L的二硫苏糖醇（DTT）也有类似作用，尤其在扩增长片段时，加入这些酶保护剂对PCR反应是有利的。（4） Mg2+Mg2+是TaqDNA聚合酶活性所必须的。因此反应中优化Mg2+浓度是非常有益的。Mg2+浓度除影响酶活性与忠实性外，也影响着引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时，酶活力显著下降；过高时，则酶催化非特异的扩增。需要指出的是，PCR混合物中的DNA模板、引物和dNTP的磷酸基团均可与Mg2+结合，降低Mg2+实际浓度。TaqDNA聚合酶需要的是游离的Mg2+。因此，PCR中Mg2+的加入量要比dNTP浓度高0.2-0

27、.5mmol/L。最好对每种模板，每种引物均进行Mg2+浓度的优化。另外还需要注意引物和模板DNA原液中如含有EDTA等螯合剂也会影响游离Mg2+浓度。优化Mg2+浓度方法：首先需要知道模板DNA量、引物和dNTP的浓度及设定的PCR循环参数。反应中的PCR缓冲液中无Mg2+。Mg2+是从10mmol/LMgCl2贮藏液中稀释浓度梯度后逐一加入反应管中。以0.5mmol/L为起始浓度递增（递增浓度为0.5mmol/L），在确定了Mg2+大概浓度后，在该浓度上下，以0.2mmol/L递增的递减几个浓度来精确确定Mg2+的最适浓度。（5） 三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）贮备dNTP液应用NaOH调p

28、H至中性，其浓度用分光光度计测定。贮备液为5-10mmol/L，分装后-20保存。在PCR的重复热循环过程中其热稳定性应为：50循环后约有50%仍为dNTP。反应中每种dNTP(dATP,Dgtp,Dttp,dCTP)的终浓度为20-200umol/L，在此范围内，PCR产物量、特异性与合成忠实性间的平衡最佳。所用的四种dNTP终浓度应相等，以使错误搀入率降至最低。开始发明PCR时，以Klenow片段催化DNA的合成，其dNTP浓度要求1.5mmol/L,而耐热DNA聚合酶的应用使dNTP的使用浓度明显降低，这可减少在非靶位点的错误引导和降低dNTP的错误搀入，从而改善了PCR的特异性与忠实性

29、。最低的适宜dNTP浓度可根据特定靶序列长度和碱基组成来确定。如在100um反应液中，每种dNTP若为20umol/L，理论上足以合成纤维.6ugDNA或10umol/L的400bp序列。有报道应用每种Dntp2umol/L可成功检出107拷贝DNA分子中一个ras点突变。但如此低浓度的dNTP在常规PCR中应避免。因为保持四种dNTP的浓度均在每种dNTPKm值（10-15umol/L）以上,对保持碱基搀入忠实性是很重要的。Dntpr 浓度大于50mmol/L时会抑制TaqDNA聚合酶活性。另外，dNTP的类似物也可搀入PCR产物。（6） 耐热DNA聚合酶自从耐热TaqDNA聚合酶引入PCR

30、后，又有多种耐热DNA聚合酶（VENT和Tth等）相继用于PCR。关于各种耐热DNA聚合酶的性质读者可参阅相关文献，但目前仍以TaqDNA聚合酶应用较多。不同来源聚合酶制备条件、测定方法和（或）单位定义有所不同，使用时需要加以注意。下面讨论的酶使用情况是以PE-Cetus公司生产的TaqDNA聚合酶为依据的。在其它参数最佳时，每100ul反应液中含1-2.5U(比活性为20U/pmol)TaqDNA聚合酶为佳。然而，酶的需要量可根据不同的模板分子或引物而变化。当优化PCR时，最好在每100ul反应体积中加入0.5-5U酶的范围内试验最佳酶浓度。如果酶浓度太高，则琼脂糖凝胶电泳中会出现非特异扩增

31、带；过低时，则靶序列产量很低。PCR后可通过下述方式之一灭活TaqDNA聚合酶：99-100加热10min；加入EDTANa2至10mmol/L以螯合Mg2+；酚-氯仿捕风抽提、乙醇温沉淀PCR产物。（7） 温度循环参数 变性温度与时间PCR变性的操作步骤很重要。此步若不能使靶基因模板和（或）PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。典型的变性条件是95,30s,或97,15s,更高的温度可能更有效，尤其是对富含G+C的靶基因。DNA在其链分离温度（strand separation temperature,Tss）时的变性时间只需几秒钟，然而，反应管内部达到Tss还需要一定时间。变性温度太高会

32、影响酶活性，最简单的方法论是在加TaqDNA聚合酶前先使模板在97变性7-10min,在以后的循环中，将模板DNA在94或95变性1min,对PCR成功亦有益处。环状质粒DNA模板最好通过酶切线性化，因环状DNA复性极快。在扩增短片段（100-300bp）时，可用简便、快速的两步PCR法，同时在5-10个循环后，将变性温度降至87-90可改善PCR产物产量。具体降低程度则根据具体反应和使用的PCR仪而定。 复性温度与时间如果说变性温度是PCR反应成败的关键，那么复性温度则决定着PCR的特异性。引物复性所需要的温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。合适的复性温度应低于扩增引物在PCR条件下

33、真实TM值的5。有关复性温度的计算关系读者可以参阅相关文献。确定了复性温度后，复性时间并不是关键因素，但复性时间太长会增加非特异的复性。复性时间也不能太短（30s）。如用手控制温度反应，从复性状态移至延伸状态的时间不能太长，耽误过长会增加非特异复性。 延伸温度与时间引物延伸温度一般为72(比复性温度高10左右)。不合适的延伸温度不仅会影响扩增产物的特异性，也会影响其产量。72时，核苷酸的搀入率为35-100个/s，这取决于缓冲体系、pH值、盐浓度和DNA模板的性质。72下延伸1min对于长达2kb的扩增片段是足够的。然而，延伸时间决定于靶序列长度与浓度。3kb的靶序列需要3-4min延伸，延伸

34、时间过长会导致非特异扩增的出现。PCR中前几个循环延伸时间应足够长，以使靶序列延伸完全，对很低浓度底物的扩增，延伸时间要长些。 循环数循环数决定着扩增程度。在其它参数都已优化条件下，最合适循环数取决于靶序列的初始浓度。过多的循环会增加非特异扩增产物的数量和复杂性（见平台效应）。当然，循环数太少，PCR产物量就会极低。在初始靶序列为3104、1.5104、1103和50拷贝分子时，其循环数可分别为25-30，30-35，35-40和40-45个循环。除循环数外，扩增效率也是影响扩增程度的重要因素。实验表明，以染色体DNA为模板时，第25-30个循环过程中，扩增DNA量明显增加。扩增程度（Y）、起

35、始DNA量（A）、扩增效率（R）和循环数（n）间的关系为：Y=A（1+R）n效率为100%时，25个循环后，Y=225A=33 554 432A；而效率R=90%，n=25时，Y=1.925A=9 307 649A，扩增产物减少了72%，由此可见扩增效率对扩增程度的影响。（8） 其它因素 高温启动（hot start）由于TaqDNA聚合酶在低温下仍然具有活性。因此在一般PCR反应的开始加热变性DNA后再加酶的过程中，引物可与模板发生非特异复性，这些非特异复性在达到72前就由TaqDNA聚合酶在其3端聚合上几个碱基并稳定了这种非特异复性引物。因此，可出现非特异延伸的扩增。采用高温启动法便可克服这一缺点，即使TaqDNA聚合酶仅在反应达到较高温度(70)时才发挥作用。这可通过在高温（70）下加入某些必需因子（DNA聚合酶、模板DNA、Mg2+或引物等）来控制。这种方法不仅可增加PCR的特异性，还能增加其敏感性，并有助于引物二聚体的形成和引物的自我复性。这是因为在扩增前加热可促进引物的特异复性与延伸，因此增加了有效引物的长度。 PCR促进剂二甲亚砜（DMSO）：许多耐热DNA聚合酶厂家推荐在PCR反应中加入10%DMSO，这可能是DMSO有变性DNA的作用。DMSO的使用对大肠杆菌DNA 聚合酶Klenow片段是有益的，但对TaqDNA聚