第八章 抗生素

1、,第八章 抗生素类药物的分析 （Antibiotics）,.,第一节：概述,1、定义：抗生素是某些微生物的代谢产物或合成 的类似物，在小剂量的情况下能抑制微生物的生长 和存活，而对宿主不会产生严重的毒性。,2、特点：由生物体产生或人工合成 化学纯度低 结构、组成复杂 对他种生物体有抑制作用,3、名称演变：抗生素抗菌素抗生素 60-70年 80年后,.,一、抗生素类药物一般检查项目： 鉴别试验: 用化学法、物理化学法以及生物学法来确认是哪种抗生素 毒性试验: 控制药品中的毒性物质 无菌试验: 检查药品中有无杂菌污染 热源试验: 控制药品中的致热物质,.,水分测定: 控制水分含量 溶液澄明度检查:

2、 检查不溶性物质 溶液pH试验: 测定pH 降压试验: 检查有降压作用的杂质 效价测定: 有效成分测定,.,抗生素药品分析常用的方法：,物理方法:旋光法、紫外、红外、色谱等 化学方法（专属性不强）：功能团反应，鉴别和含量的测定。容量分析法：酸碱滴定（青霉素含量测定）和碘量法。 生物学方法：酶反应、微生物法测定效价,.,第二节 抗生素类药物的鉴别,鉴别方法：,理化方法 生物学法：微生物法,官能团显色： 内酰胺环 光谱法：UV、IR 色谱法:TLC、HPLC,.,根据化学结构分类： 内酰胺类抗生素：青霉素、头孢菌素 氨基糖苷类：链霉素、庆大霉素 四环素类：四环素、金霉素 大环内酯类：红霉素、麦迪霉

3、素 多稀大环类：两性霉素 多肽类：多粘菌素 苯烃胺类：氯霉素 蒽环类：阿霉素 其他：,抗生素类药物的分类,.,.,一、-内酰胺抗生素的结构特征,指分子中含有由四个原子组成-内酰胺环 是该类抗生素发挥生物活性的必需基团 和细菌作用时，内酰胺环开环与细菌发生酰化作用 抑制细菌的生长。 因-内酰胺由四个原子组成，分子张力较大，化学 性质不稳定易发生开环导致失活。,.,二、分类：经典结构药物,.,分类：非典型结构药物,.,性质1 ：酸性,分子中游离羧基具有相当强的酸性，能与无机碱或某些有机碱形成盐。 其碱金属盐易溶于水，而有机碱盐难溶于水，易溶于甲醇等有机溶剂。,.,性质2 ：旋光性,青霉素族分子中含

4、有三个手性碳原子，头孢菌素族含有两个手性碳原子，故都具有旋光性。 根据此性质，可用于定性和定量分析。,.,性质3 ：紫外吸收特性,1、青霉素类 母核无明显UV 多数有苯环取代基,.,性质4 ：不稳定性,干燥条件下青霉素盐稳定。青霉素水溶液在 pH6-6.8时较稳定。 -内酰胺环是该类抗生素结构最不稳定的部分。,四元环张力大,酰胺键易水解,不稳定性因素,、羟胺,.,例,青霉素的降解反应,青霉素,青霉噻唑酸,H2O/OH,青霉素酶,青霉酸,H2O,pH2,100,青霉噻唑酰基羟胺酸,NH2OH,青霉烯酸,pH4,青霉胺,CO2,青霉醛,HgCl2,例,.,（一）色谱法,1、TLC法,对照品对照法,

5、2、HPLC法,二、鉴别试验,.,头孢氨苄 max = 262nm,青霉素V钠 A280nm/A264nm = 1.301.50,2紫外分光光度法(UV),（二）光谱法,1、IR法,.,.,2、,IR法,3180cm-1 酰胺N-H,1780cm-1 内酰胺 C=O,3470cm-1 酚羟基O-H,1690cm-1 仲酰胺C=O,1250cm-1 酚羟基C-O,以阿莫西林为例,.,-内酰胺环,酰胺,羧基,.,（三）茚三酮反应,某些具有-氨基的本类药物，如氨苄西林，遇茚三酮即显蓝紫色。,.,-氨基、伯胺 某些羟基胺类,酮式,烯醇式,茚三酮,茚三酮,缩合,蓝紫色,.,（四）各种盐的反应,青霉素族、

6、头孢菌素族药品中，许多制成钾盐或钠盐供临床使用，因而可利用其火焰反应进行鉴别。,1.火焰反应,.,三、特殊杂质的检查,本类抗生素的特殊杂质主要有高分子聚合物、有关物质、异构体等，一般采用HPLC法控制其限量，也有采用测定杂质的吸收度来控制杂质量的。,.,（二）有关物质和异构体 例：头孢氨苄中有关物质的检查（反相HPLC法） 取本品，流动相，成0.4mg/ml，得供试液 供试液，流动相，成4ug/ml，得对照液 对照品，流动相，成4ug/ml，得杂质对照液 杂质 ，外标法。 其他杂质，主成分自身对照法。 头孢氨苄以青霉素钾为原料，经氧化、扩环、裂解得7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸（7-ADCA），再

7、与侧链a-苯甘氨酸缩合而成。这两种原料有可能成为主要杂质。,.,（三）杂质吸收度的检查 例：青霉素钠（钾） 取本品，加水，成1.80mg/ml。 A280nm 控制杂质不得大于0.10， A264nm 控制青霉素钠（钾）的含量应为0.80-0.88 。,.,（四）有机溶剂,氨苄西林钠：CH2Cl2 GC 头孢哌酮：丙酮 GC 头孢他啶：吡啶 HPLC,.,四、含量测定,青霉族和头孢菌素族的含量测定大多采用理化测定方法中的HPLC法,特点 快速、高效、灵敏 专属性强、重现性好 一法多用（鉴别、检查、含测）,.,哌拉西宁 原料药 含量测定 色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇0.2mo

8、l/L磷酸二氢钠溶液10氢氧化四乙基铵溶液水（400503547）用磷酸调节pH值至5.5为流动相。检测波长为254nm。,.,二 氨基糖苷类抗生素,链霉素 双氢链霉素 新霉素 卡那霉素 庆大霉素 巴龙霉素,.,链霉素,链霉胍 + 链霉糖 + N-甲基-L-葡萄糖胺,链霉糖,N-甲基-L- 葡萄糖胺,链霉胍,.,绛红糖胺 + 脱氧链霉胺 + 加洛糖胺,绛红糖胺,紫素胺,2-脱氧链霉胺,加洛糖胺,N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺,.,庆大霉素C复合物 庆大霉素C1 R=H R1、R2=CH3 庆大霉素C2 R=R2=H R1=CH3 庆大霉素C1a R、R1、R2=H 庆大霉素C2a R=CH

9、3 R1= R2=H 庆大霉素C2b R=R1=H R2=CH3,.,多与硫酸成盐,链霉素 3个,庆大霉素 5个,碱性中心,（一）碱性,（四）苷的水解与稳定性,链霉素 pH57.5 庆大霉素 pH212,链霉素在230nm处有吸收， 庆大霉素、奈替米星无,.,.,羟基胺结构,硫酸庆大霉素鉴别(1) 取本品约5mg ，加水1ml 溶解后，加0.1 茚三酮的水 饱和正丁醇溶液1ml 与吡啶 0.5ml，在水浴中加热5 分 钟，即显紫蓝色。,.,（二）Molisch反应,具五碳或六碳糖的氨基糖苷类抗生素经酸水解后，在盐酸（或硫酸）作用下脱水生成糠醛或羟甲基糠醛。这些产物遇-萘酚或蒽酮呈色。,红紫色,

10、.,蒽酮呈色原理：,蓝紫色,阿米卡星鉴别 (1) 取本品约10mg，加水1ml 溶解后，加0.1 蒽酮的硫酸溶液4ml ，即显蓝紫色。,.,吡咯衍生物,红色,（Elson-Morgan反应）,H+,.,链霉糖特有反应,.,紫红,麦芽酚,.,链霉胍特有反应,（或-萘酚）,8-羟基喹啉, -萘酚,.,H+,光谱法,（八）,庆大霉素无UV吸收,.,链霉素B（甘露糖链霉素）,方法 TLC中的对照品法 （BP）,1. 来源 反应中间体,.,发酵菌种不同 工艺差别,规定控制各组分的相对百分含量 HPLC,ChP USP BP JP,.,max = 330nm,1.衍生化原理,1-烷基硫代-2-烷基 异吲哚

11、衍生物,.,RPHPLC,规定 C1 2550% C1a 1540% C2a +C2 2050%,峰面积归一化法,.,.,链霉素、庆大霉素,微生物检定法 本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。,.,离子交换色谱法 离子对色谱法 RP-HPLC法,HPLC法,.,.,苯并蒽环结构,C-4为结构,是由放线菌产生的,天然有,一、天然四环素结构特点,R1 R2 R3 R4 四环素 H OH CH3 H 53年得到 土霉素 OH OH CH3 H 50年得到 金霉素 H OH CH3 Cl 48年

12、得到,.,二、作用：广谱抗生素，G+、G-、部分立克 次体、病毒、原虫等,近年来四环素类抗生素新药开发不理想,三、作用机制:干扰细菌蛋白质的生物合成 与细菌中的Mn+形成金属离子络合物,.,四、理化性质：黄色结晶性粉末,1、酸碱两性：Ar10-OH、=C3-OH为酸性 C4 N= 为碱性。可溶酸碱 临床用其碱，成HCl盐,.,2、稳定性：,.,2)pH2-6,C-4二甲胺基易发生差向异构化,失活,.,3)OH-下C环开裂,失活,.,五、临床用缺点：耐药性严重 吸收不好，血药浓度低 影响骨骼生长,孕妇及儿童为何不可用四环素：牙齿变黄、骨骼生长抑制,4) 和金属离子的反应,含OH、C=O、=C-O

13、H等基团，可与Mn+生成不溶 性螯合物,如成Ca、Mg、Fe盐等,生成不同色,.,（1）酸性下降解,max = 445nm,max = 435nm,橙黄色,.,脱水四环素,.,TC,ETC,ATC,EATC,.,.,.,1mol/L盐酸-甲醇（1100） 0.01mg/ml,UV法,（二）,（三）荧光法,.,HPLC法,（五）,EDTA 克服痕量金属造成的 拖尾现象,（六） IR 法,硅藻土做载体,.,HPLC法,自身稀释对照法,盐酸四环素,.,.,杂质吸收度,.,HPLC法（外标法）,.,第五节 抗生素类药物中高分子 杂质的检查,1.高分子杂质 分子量大于药物本身的杂质总称。,.,蛋白、多肽、多糖或抗生素与蛋白、多肽、多糖的结合物。主要来自于发酵工艺，致敏，如青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽。 药物的自身聚合物，来自于生产、贮存过程。可引发过敏。,外源性杂质,内源性杂质,.,.,.,.,3.高分子杂质的质控方法（1）凝胶色谱法测定高分子杂质：使高分子杂质 与药物分离。（2）高分子杂质的控制方法-自身对照外标法 原理：测定在Kav=0处 药物缔合物的峰响应 指标 样品中高分子杂质的响应指标 按外标法计算，得样品中高分子杂质 相当于药物本身的相对含量。,.,（3）高分子杂质的分析方法简单测定系统：葡聚糖凝胶G-