生物化学课件：6 酶

1、第4章 酶,什么是酶？ 酶是由活细胞产生的、能对特异底物进行高效催化的生物大分子（催化剂），绝大多数酶的化学本质为蛋白质。酶是生物催化剂,Enzyme：in yeast enzyme是希腊文 en = in ， zyme = yeast,酶催化的生物化学反应，称为酶促反应 在酶的催化下发生化学变化的反应物，称为底物，（Substrate，S）,酶及生物催化剂概念的扩展,克隆酶、遗传修饰酶蛋白质工程新酶,生物催化剂 （Biocatalyst）,蛋白质类： Enzyme,(天然酶、人工酶),核酸类：Ribozyme ; Deoxyribozyme,模拟酶：一类利用有机化学方法合成的比天然酶简单的非

2、蛋白分子,1. 提高反应速度，不改变平衡点; 2. 只起催化作用，本身不消耗； 3. 降低反应的活化能。,与一般催化剂相同的特点,酶催化作用的特点,活化能(activation energy) 分子从常态转变为容易发生化学反应的活跃状态所需要的能量称为活化能。 酶催化反应的实质：降低反应的活化能,酶作为生物催化剂的特点,常温、常压、中性,1. 反应条件温和,2. 高效性,3.专一性（ Specificity ）,解释酶专一性的三种模型： （1）锁与钥匙学说 （2）诱导契合学说 （3）“三点附着”模型,酶的化学本质及其组成,据酶分子组成分类,单纯蛋白质酶类,结合蛋白质酶类,酶蛋白质,辅助因子,金

3、属离子 小分子有机物,据酶蛋白特征分类,单体酶 寡聚酶 多酶复合体,由一条肽链组成,由多个亚基以非共价键结合组成，单个亚基没有催化活性。大多为代谢调节酶,由几个独立的酶组合起来形成复合体，催化连续的反应，反应效率高,国际系统分类,根据酶催化的有机化学反应类型，国际生物化学协会酶学委员会规定，将酶分为六大类： 1、氧化还原酶: A.2H + B=A + B.2H 2、转移酶: A.X + B=A + B.X 3、水解酶: A-B + H2O=A.H + B.OH 4、裂合酶: A-B=A + B 5、异构酶: A=B 6、连接酶: A + B + ATP=A-B + ADP + Pi,酶活性,酶

4、活性：也就是酶活力(enzyme activity)，是指酶催化指定化学反应的能力。 酶促反应速度：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。（单位：浓度/单位时间） 酶活力单位（U）：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量 国际单位（IU）：在25、测量的最适条件（如pH及底物浓度等）下，1分钟催化1 mol底物转化为产物所需的酶量，称一个国际单位。,比活力：每mg蛋白含有的酶活单位数 U/mg蛋白质,酶的比活力（Specific activity）,表示酶的纯度,比活力= 酶活力（U/mL）/蛋白质浓度（mg/mL）,酶蛋白纯化的一般流程,酶活性部位,活性部位（活

5、性中心）：酶分子中结合和催化底物的活性部位，包括底物结合部位、催化部位,过渡态,酸碱催化 共价催化 靠近与定向效应 底物形变和诱导契合,酶的催化机制,酶促反应动力学,酶促反应动力学：主要研究酶催化的反应速度以及影响反应速度的各种因素的科学。 影响酶反应速度的因素有： 底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂、抑制剂等。 在探讨各种因素对酶促反应速度的影响时，通常测定其初速度来代表酶促反应速度，即底物转化量5%时的反应速度。,酶浓度对反应速率的影响,（一）底物浓度对反应速度的影响,酶的底物饱合现象中间络合物学说,酶与底物首先生成一个中间络合物，然后中间络合物进一步分解成产物和游离的酶,米氏方程推导

6、设定的3个条件： 反应速率为初速率，因为此时反应速率与酶浓度呈正比关系，避免了反应产物以及其他因素的干扰 酶底物复合物处于稳态即ES浓度不发生变化 符合质量作用定律,（二）酶促反应的动力学方程式,酶反应动力学最简单的模型由Lenor Michaelis和Maude Menten于1913年提出，因此又名为Michaelis-Menten模型或M-M模型。 1925年，G.E.Briggs和James B.S.Haldane使用稳态近似法（steady-state approximation，SSA）提出一个略为复杂的模型。,S：底物浓度 v：不同S时的反应速度 Vmax：最大反应速度 Km：米

7、氏常数,根据中间络合物学说：,1. 米氏方程的推导,k,k,ES形成速度v1= K1 E S ES分解速度v2= (K2 + K3 ) ES,1925年Briggs和Haldame提出了稳态的概念：,所谓稳态是指反应进行一定时间后，ES的生成速度和ES的分解速度相等，此时ES的浓度不再改变，达到恒态，也称稳态。,K1 E S = (K2 + K3 ) ES,由于E 与ES之和为总的酶浓度Et ,即: Et= E + ES E = Et - ES,将代入:, 酶促反应速度由ES决定，而= K3 ES,当S 升高,所有E为S所饱和时,即：Et = ES,此时达到最大反应速度Vmax：Vmax= K

8、3 Et ,将代入，得米氏方程:,米氏方程的变化：,1. Km S 时： v = Vmax S /Km 初速度与S成正比，一级反应。 2. 若Km S时： v = Vmax v与S无关，零级反应,酶反应速度与S的关系,当 = Vmax2时，,Km：酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度。 Km的单位为mol/L。,米氏方程的变化：,（1） Km是酶在一定条件下的特征物理常数，与酶的性质有关，与酶的浓度无关。通过测定Km的数值，可鉴别酶。,2. 米氏常数（Km）的意义,与pH 、温度、离子强度、酶及底物种类有关,（2） 不同的酶有不同的Km值；对于同一个酶来说，每一个底物都有一个相应的Km值。,2

9、.米氏常数（Km）的意义（续）,（3） Km可以推断某一代谢物在体内可能的代谢 途径,当丙酮酸浓度较低时，代谢走哪条途径决定于 Km最小的酶。,2.米氏常数（Km）的意义（续）,（4） 一般情况下，1/Km可以近似地表示酶对底物的亲和力大小， 1/Km愈大，表明亲和力愈大。（根据Km可判断酶的天然底物，Km最小的底物称该酶的最适底物或天然底物）,2.米氏常数（Km）的意义（续）,在一定的酶浓度下，Vmax是一个常数，它只与底物的种类及反应条件有关。 K3代表酶被底物饱和时，每个酶分子每秒钟转换底物的分子数，称为转换数（TN，或催化常数，kcat） K3（ Kcat）值越大，表明酶的催化效率越高

10、。,3. Vmax与K3（ Kcat）的意义,Vmax=K3 E,4. Kcat/Km 表示酶的实际催化效率 S/Km=0.01-1.0,SKm 时：,Kcat/Km可以客观地比较不同的酶或同一种酶催化不同底物的催化效率。,Kcat/Km可以客观地比较不同的酶或同一种酶催化不同底物的催化效率,5. 米氏常数的测定,基本原则： 将米氏方程变化成相当于y=ax+b的直线方程，再用作图法求出Km。,1/V,-1/Km 0 1/S,斜率= Km/ Vmax,1/Vmax,（1）Lineweaver-Burk 双倒数作图法,该作图法的缺点： 实验点过分集中在直线的左下方，而低浓度S的实验点又因倒数后误差

11、较大，往往偏离直线较远。从而影响Km和Vmax的准确测定。,（2）v对 作图（Eadie-Hofstee法）,（3） S/v 对S作图（Hanes-Woolf法）,（4） Eisenthal和Cornish-Bowden直接线性作图法,抑制作用：使酶的必需基团的化学性质改变而降 低酶活性、甚至使酶完全丧失活性的作用； 引起作用物质称为抑制剂 变性作用：由于酶分子的次级键（酶分子结构）受到破坏而使酶活性下降或失活。,抑制剂对酶反应的影响,什么是酶的抑制作用？,根据抑制剂与酶作用方式的不同,能否用透析、超滤等物理方法除去抑制剂，使酶复活,抑制作用的类型,抑制剂与酶非共价键结合，抑制作用可通过透析等

12、方法除去。,1. 可逆抑制作用,抑制剂与底物竞争酶的活性中心，从而干扰了酶与底物的结合，使酶的催化活性降低，称为竞争性抑制作用。,（1）竞争性抑制,磺胺类药物的抑菌机制： 与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶,二氢蝶呤啶 对氨基苯甲酸 谷氨酸,对氨基苯甲酸(PABA),竞争性抑制细菌叶酸形成，抑制细菌繁殖，人通过食物直接补充叶酸，对人无毒害。,1939,竞争性抑制作用的动力学,竞争性抑制的速度方程与图形特征,Km,（2）非竞性抑制,抑制剂既可以与酶结合，也可以与ES复合物结合，使酶的催化活性降低，称为非竞争性抑制。,Noncompetitive inhibition,非竞争性抑制的速度方程与图形特

13、征,Vmax减小，部分酶始终失活Km不变，亲和力不受影响,Vmax,非竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似； 底物和抑制剂分别独立地与酶的不同部位相结合； 抑制剂对酶与底物的结合无影响，故底物浓度的改变对抑制程度无影响； 动力学参数：Km值不变，Vm值降低。,非竞争性抑制的特点：,抑制剂不能与酶结合，只与ES复合物结合并阻止产物生成，使酶的催化活性降低，称酶的反竞争性抑制。,（3）反竞争性抑制,反竞争性抑制的速度方程与图形特征,Km、Vmax都变小,2、不可逆抑制作用： 抑制剂与酶必需基团以共价键相连，使酶丧失活性, 不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂，使酶恢复活性,很多为剧毒物

14、质，如重金属、有机磷、有机汞、有机砷、氰化物、青霉素、毒鼠强等。,对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）与Trypsin底物等对甲苯磺酰-L-赖氨酰甲酯结构相似,（1） 非专一性不可逆抑制剂 重金属离子 Ag+ 、 Cu2+ 、 Hg2+ 、 Pb2+ 、 Fe3+ 高浓度时可使酶蛋白变性失活； 低浓度时对酶活性产生抑制。 通过加入EDTA解除,有机磷化合物 （二异丙基氟磷酸（DFP）和许多有机磷农药）,或,R1、R2 : 烷基； X: -F, -CN等,抑制机理：与蛋白酶及酯酶活性中心Ser-OH形成磷脂键。 强烈抑制胆碱脂酶的活性（神经毒气）。,沙林毒气 甲氟膦酸异丙酯,乙酰胆碱为神经递质，过度积累使神经系统处于过度兴奋状态，引起神经中毒症状,有机磷化合物中常用的有机磷杀虫剂，如1605、敌百虫、敌敌畏、乐果等。,如何紧急救治？,解磷定 置换结合的有机磷化合物， 解除抑制作用,1. 基团特异性抑制剂 这类抑制剂在结构上与底物无相似之处，但能共价修饰酶活性中心上的必需侧链基团而导致酶活性不可逆的失活。由于许多氨基酸残基含有亲核侧链基团，所以充当基团特异性抑制剂的一般是亲电试剂。 2. 底物类似物抑制剂 这类抑制剂在结构上相