第07章 高效液相色谱分离技术B.ppt

1、第七章 高效液相色谱法,三、示差折光检测器 四、蒸发光散射检测器 五、化学发光检测器 7-3 反相色谱 一、固定相 二、流动相 三、保留机理 四、色谱条件选择,7-1 一般流程及 分离原理 一、简介 二、一般分离流程 三、原理 四、色谱分离的特点 7-2 检测器 一、紫外吸收检测器 二、荧光检测器,0,六、树脂预处理及再生 七、实验技术 八、 离子交换法的应用 7-5 凝胶色谱 一、基本原理 二、凝胶的种类 三、操作方法 四、应用,7- 4 离子交换色谱 一、离子交换 二、填料 三、IEC的保留机理 四、离子交换色谱条件的选择 五、影响离子交换的有关因素,0,7-6 高效液相色谱的实验技术 一

2、、柱技术 二、洗脱方式 三、流动相 四、分离模式的选择,0,7-7 高效液相色谱的应用 一、制备分离 二、样品前处理 三、HPLC应用 四、应用实例,第七章 高效液相色谱法,以液体为流动相的色谱法称为液相色谱法。采用普通规格的固定相及流动相常压输送的液相色谱法则为经典液相柱色谱，其柱效低、而且一般不具备在线检测器，通常作为分离手段使用。HPLC是以经典的液相柱色谱为基础，引入了气相色谱的理论与实验方法，流动相改为高压输送，采用高效固定相及在线检测等手段，发展而成的分离分析方法。该法具有分离效能高、分析速度快及仪器化等特点，因而称为高效液相色谱法。,7-1 一般流程及分离原理 一、简介 1.与经

3、典的液相柱色谱法相比 (1)柱内径，填充剂粒度、均匀性，新型固定相的问世 分离效率。 (2)柱长，填充剂机械强度，供液压力和进样压力，流动相流速（15ml/min）分离速度（78个峰/10min）。 (3)采用光学原理的检测器灵敏度。,2.与GC相比 (1)样品受限制少，对易分解、不容易气化、分子量大、高极性的有机物（7080%的有机物）可用HPLC分析。 (2)不用制备衍生物，减少了误差。 (3)进样量大（500800L），易制备。 (4)分离效率降低。,二、一般分离流程,高效液相色谱仪及一般分离流程见图7-1。 三、色谱原理 1、概念 HPLC：以溶剂或某种溶液为流动相，以装在柱子里的固体

4、为固定相，用高压输液泵将流动相压入柱子，使样品组分在柱子里进行分离的柱色谱法。 2、分类 根据色谱柱所用填充剂的不同，HPLC分离原理有：吸附色谱，分配色谱, 键合相色谱，离子交换色谱，凝胶色谱等。,图7-1,用液液分配色谱的机理来讨论高效液相色谱的普遍性问题。,色谱的分离过程(见图7-2)。（a）在装好填料的柱子中加上样品，然后用溶剂洗脱，样品中各组分（若有A、B、C三个组分）的分子沿流动相流动方向移动。（b）和（c）表示组分的移动。（d）表示经过一段时间的洗脱以后，A、B、C三个组分已经被分离开，不同组分在柱子中移动速度不同而得到了分离，也就是说不同的组分在柱子上存在差速迁移现象。,另外，

5、对照（a）和（d）可以发现刚上样后，溶质分子形成的色带（又叫谱带）较窄，而到了（d）中，各组分的谱带明显变宽，这说明同一组分沿柱子移动时，存在着扩散问题，即谱带的扩散。,图7-2 三组分样品分离过程示意图,四、色谱分离两大特点：差速迁移、谱带扩展,差速迁移：不同组分在柱子中移动速度不同而使其混合物得到分离，即不同的组分在柱子上存在差速迁移现象。引起原因：在分配色谱中，由于不同组分在固液两相的分配系数不同引起；在离子交换色谱中，主要是由于各组分对固定相的静电引力不同造成的。 谱带扩展：同一组分沿色谱柱移动时，色带由窄变宽，即同一组分在柱子上存在谱带扩展现象。产生原因：由于同一个化合物的不同分子，

6、在通过柱子时平均迁移速度不同造成的。其原因是由于涡流扩散和各种传质情况的差异造成了同一物质不同分子的差速迁移。,7-2 高效液相色谱检测器 目前应用较多的有紫外吸收检测器、荧光检测器、电化学检测器、化学发光检测器、蒸发光散射检测器、安培检测器及示差折光检测器等。 1.紫外吸收检测器（ultraviolet detector , UVD） 紫外检测器是HPLC应用最普遍的检测器，利用紫外分光光度计的原理对各组分进行检测，属浓度型检测器。灵敏度、精密度及线性范围均较好。既用于等浓度，也用于梯度洗脱。但只能用于对紫外线有吸收的组分的检测，且流动相的选择有一定的局限性，其截止波长必须小于检测波长。,2

7、.荧光检测器（fluorophtometric detector, FD） 荧光检测器利用荧光分光光度计的原理对各组分进行检测，其灵敏度高于紫外吸收检测器，但只适用于能产生荧光或其衍生物能发荧光的物质。主要用于氨基酸、多环芳烃、维生素、甾体化合物及酶等的检测。在用于氨基酸检测时，需用衍生法制备衍生物，其衍生法分为柱前与柱后衍生两种，常用邻苯二甲醛或异氰硫基苯为衍生化试剂，是分析氨基酸应用最广的方法。,3.示差折光检测器（RI）,属于通用型检测器。其检测原理是液体都有折光指数，很少有两种液体具有相同的折光指数，所以 化合物都可用这种检测器检出。当流动相恒定地流过检测池时，其折光指数不变，仪器得到

8、一条基本平直的基线。当有组分峰流过去时检测池时，折光指数发生变化，记录仪记下这信号，即为色谱图。其缺点：灵敏度较少低，检出下限为10-7g/mL；易受温度和流速的影响；不能进行梯度洗脱。,4.蒸发光散射检测器（evaporative light scattering detector, ELSD） 蒸发光散射检测器是20世纪90年代出现的最新型通用检测器，可用于挥发性低于流动相的任何样品组分的检测，但对于有紫外吸收的样品组分检测灵敏度较低，因而主要用于糖类、高分子化合物、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸、甘油三酯及甾体类等几十类化合物。,这种检测器是示差折光检测器的理想替代品。其检测原理是：将

9、流出色谱柱的流动相及组分先引入已通气体的蒸发室，加热，使流动相蒸发而除去；样品组分在蒸发室内形成气溶胶，而后进入检测室；用强光或激光照射气溶胶产生光散射，测定散射光强而获得组分的浓度信号。,5.化学发光检测器 化学发光检测器是近年来发展起来的高选择性及高灵敏度的新型检测器，其设备简单，自身发光，不需光源，价格便宜，是一种有发展前途的检测器，可用于药物代谢分析及免疫研究。其检测原理是：将流出色谱柱的组分与发光试剂混合，产生化学发光反应，光辐射可用光导纤维传输，由光电倍增管检测，从而获得信号。,几种主要检测器的基本特性,7-3 反相色谱（RPC）,HPLC发展早期，其填料常用固体吸附剂作固定相，这

10、种色谱叫液固吸附色谱；另一类填料常采用在固相载体上涂上一层固定液作为固定相（其代替物是键合填料）， 这种色谱是液液分配色谱。键合填料即将配基直接键合在固体基质上作为固定相。反相色谱填料是其中之一。 所谓反相色谱或正相色谱，其叫法是根据填料和流动相的相对极性来区别。流动相极性弱于固定相的液相色谱法叫正相色谱。如以硅胶为吸附剂，以有机溶剂为流动相的吸附色谱中，由于硅胶（SiO2XH2O）表面大量硅羟基的存在，其极性强于流动相，故是正相色谱。流动相极性强于固定相的液相色谱叫反相色谱。如以有机溶剂加水作流动相，以烷基、苯基键合相填料作固定相的色谱就是反相色谱。反相高效液相色谱是应用最广的一类高效液相色

11、谱法。,一、固定相,由固体刚性基质和键合在基质上的配基组成。 （1）基质（担体）：硅胶。其表面有大量深浅和孔径不同的孔隙，这样就使硅胶的表面积大大扩大了。一般常用孔径在6-12nm。 （2）配基：配基都是不同类型的有机基团。采用直接键合的方法固定到基质上。 其方法：通过有机氯硅烷与硅胶表面硅羟基反应键合上去的。即：,非极性键合相 此类键合相表面基团为非极性烃基，如十八烷基键合相（十八烷基键合硅胶，octadecylsilane, ODS, C18）以及辛烷基（C8）、乙基、甲基和苯基键合相。其中苯基可诱导极化，所以也可视为弱极性键合相。 国内产品有YWG-C18和YWG-C8 和YWG-C6H

12、5，国外代表性产品有：Nucleosil C18，Spherisorb ODS-2，Zorbox- C8等。HPLC中80%的分离工作所用的固定相都是ODS ，流动相为不同比例的水和甲醇，所以是反相技术。为提高固定相极性，可缩短烷基的链长度，选用YWG-C8为固定相。YWG-C6H5为反相，用于分离芳香族化合物。,中等极性键合相 常见的中等极性键合相有醚基键合相。这种键合相既可作正相又可作反相色谱的固定相，视流动相的极性而定。国内产品有YWG-ROR，进口产品有Permaphase-ETH。此类键合相应用较少。 极性键合相 常用的极性键合相有氨基、氰基键合相用。这种键合相既可作正相又可作反相色

13、谱的固定相。国内产品有YWG-NH2、YWG-CN 和YQG-NH2、YQG-CN ；进口产品有Nucleosil NH2或CN ，Lichrosorb NH2或Zorbox-CN。,二、流动相,极性溶剂。常用： 有机溶剂(如甲醇、异丙醇、乙腈、二氧六环)水 在这些溶剂中，水的洗脱能力最弱。所以在反相色谱的梯度洗脱中，A液以水为主，B液以有机溶剂为主。洗脱过程中逐渐向流动相中添加有机溶剂，就达到了逐渐增加洗脱强度的目的。相反，如果向水中添加无机盐，则是减弱了洗脱剂的强度，增强了样品组分在柱子上的保留。 RPC中应用最广的流动相是:水甲醇 、水乙腈 注：甲醇和乙腈一般用色谱纯，而水应当是二次蒸馏

14、水或蒸馏水经脱离子处理,三、保留机理 （两种模型）,（1）疏溶剂理论 一个分子有亲水部分和疏水部分两类基团。亲水基团如OH、-NH2、-COOH和-SH等极性官能团，疏水基团如苯环-CH3、-CH2-等基团。 当一个非极性溶质或分子中的非极性部分放入一个极性溶剂中时，这个非极性部分（即疏水性基团）与极性溶剂之间相互产生了一个斥力，分子中的非极性部分总是趋向于与其他非极性部分聚集，以减少与极性溶剂的接触面积，减小表面张力，使体系能量最低。这种溶质分子的非极性表面区域在水中倾向于减小与极性溶剂的接触面积的效应叫做疏水作用或疏溶剂效应。,在RPC中，有机水溶液作流动相，溶质在非极性的配基（烷基、苯基

15、等）上的保留，就是由于溶质中的疏水基团倾向于与配基结合而造成的。 溶质中的疏水性越强，与配基的结合地越牢。所以有机同系物中随着烷基链长的增加，其保留值也增大。,样品分子和固定相上的配基在流动相中都是溶剂化的。当样品分子保留在柱子上时，样品分子与配基接触，两者之间结合面上的溶剂化分子被“挤”走，进入流动相。被“挤”走的溶剂分子有Z个。当样品分子被洗脱下来时，样品分子进入了流动相，样品分子与配基的接触面重新被溶剂化，重新溶剂化所需的溶剂分子是Z个，与保留时被“挤”走的溶剂分子相等。,（2）计量置换模型,计量置换模型的数学表达式为：,lgK=lgI-ZlgD0 式中K为容量因子；lgI为常数；Z为配

16、基础与样品分子接触面在样品分子被保留时释放出来的溶剂分子数； D0为洗脱剂中强溶剂的浓度。 在反相色谱中，样品与配基靠疏水作用结合。而洗脱液如水甲醇体系中，醇比水更容易使疏水性配基和样品溶剂化，在保留与置换中，醇在起作用，所以上式中D0为甲醇浓度。当柱子、溶剂、样品分子、温度固定后，Z为常数。以lgK对lgD0作图可得一条直线。通过此表达式，使洗脱剂浓度与保留值建立了直线的关系式。,四、反相色谱色谱体系的选择,当样品组分不是离子型化合物，优先选用反相色谱来进行分离。RPC体系选择顺序：首先选柱子再选流动相，然后再考虑检测器、温度、洗脱方式、进样量等条件。 （1）柱子： 常选 ODS柱（其配基为

17、十八烷基）。该柱子优点：疏水性强，分离性能好，样品分子在柱内保留值大，应用面广。 另外：对于生物蛋白质（大分子量），一般用C4-C8的填料柱； 含-CN或-NO2的化合物，一般用苯基型填料柱；多糖、类固醇这样的强极性物质可以使用氨基柱、氰基柱。氨基柱的配基为-RNH2，它可以在一定的条件下，分别当正相柱、反相柱和离子交换柱使用，是一种特殊的填料。,（2）流动相,首选：甲醇水 体系 若纯甲醇的洗脱能力还不够强，则要添加或换用其他洗脱能更强的溶剂。常用的溶剂洗脱能力强弱的顺序为： 水乙腈甲醇二氧六环四氢呋喃异丙醇,（3）检测条件 若物质有发色团有紫外吸收，用紫外检测器。检测波长最常用254nm，因

18、为此波长下灯源光度最强。 若样品组分无紫外吸收，则可选示差折光检测器。,（4）柱温 rt,总之，选择色谱条件是根据“样品组分”确定的。,7- 4 离子交换色谱法（IEC） 一、离子交换 1.离子交换色谱概念 利用离子交换剂作为固定相，以适宜的溶剂作为流动相，使被分离混合物中的各组分按其离子交换亲和力的不同而得到分离。 2.离子交换剂（离子交换树脂） 离子交换剂是不溶性高分子化合物，其分子中含有解离性离子交换基团，当一定量的水溶液通过交换柱时，能与存在于溶液中的阳离子或阴离子物质起可逆的交换作用。,3.离子交换剂的分类,阳离子 交换树脂,强酸型 弱酸型,PO3H COOH,OCH2COOH C6

19、H4OH,SO3H,阴离子 交换树脂,强碱型 弱碱型,N(CH3)3X,NR2 NHR NH2,4.离子交换树脂的交换原理 (1)强酸型阳离子交换树脂 （SCX） 电离程度不受溶液pH变化的影响，在pH 114范围内均能进行离子交换反应。,聚苯乙烯强酸型树脂： 一般为黑褐色，是最常用的强酸型阳离子交换树脂，以苯乙烯为单位，向上下左右延伸的网状结构是它的母体。母体上连结许多SO3H。,常见型号：国产树脂中强酸17（上海树脂厂#732）、强酸型#1（南开大学树脂厂）和国外产品Dowex50、Amberlite IR-120、Zeo Karb225、Zerolit225、wofatit K、Perm

20、utit Q、Iiwatit S100都属于这种。 特性：这种树脂很稳定，使用得当，经过几百次交换，交换当量也改变不大。对各种试剂也较稳定，如较长时间浸在5%氢氧化钠、0.1%高锰酸钾、过氧化氢水溶液、0.1M硝酸中也不会改变性能。不溶于水和一般有机溶剂，耐热性也比其他树脂好，必要时可以在沸水浴上l00左右处理。,酚磺酸型树脂 是在聚乙烯树脂出现以前就被广泛应用的强酸性树脂，可以用对羟基苯磺酸和甲醛缩合而成。 国产树脂中华东强酸阳42和国外产品Amberlite IR-100、IR-105、Dowex30、Zerolit215、Zeo Karb215、wofatit K 、wofatit KS

21、都属于这种。这种树脂一般为黑色，交换量比苯乙烯树脂小，遇碱或氧化剂时，性能易变化。在不同pH的碱性溶液中离子交换的作用不同，因为有以上缺点，故应用范围较小。,(2)强碱型阴离子交换树脂 (SAX) 电离程度不受溶液pH变化的影响，在pH 114范围内均能进行离子交换反应。,树脂的母体和苯乙烯强酸性树脂相同，区别在于母体上连结有季铵。国产树脂中强碱性201（南开大学树脂厂）、强碱性201 7（上海树脂厂717）和国外产品Nalcite SAR、Dowex1、Dowex2、Amberlite IRA-400、Ambertite lRA-410、Ambertite XE-98、PermutitS、P

22、ermutitS、Lewatit M、Zerolit FF等都届于这种。这种强碱性树脂对酸、碱和有机溶剂亦较稳定，但在浓硝酸中不稳定。游离型（OH型）比盐型（Cl型）的耐热性差，超过40-45就不稳定，因此一般商品都是Cl型。,(3)弱酸型阳离子交换树脂 (WCX) COOH电离程度受溶液pH变化的影响很大，其交换能力随溶液pH的下降而减少，在酸性溶液中几乎不发生交换反应。所以羧酸阳离子树脂的交换反应必须在pH7的溶液中才能正常进行，对酸性更弱的酚羟基树脂，则应在pH9的溶液中才能进行反应。,含有 - COOH 的树脂，母体有芳香族和脂肪族两种。脂肪族类型中用甲基丙烯酸和二乙烯基苯聚合的较多。

23、芳香族类型的用二羟基苯酸和甲醛聚合的较多。国产树脂中弱酸l0l l28（上海树脂厂#724）、弱酸性#10l（南开大学树脂厂）和国外产品Ambertite IRC-50、Wofatit C、Zerolit 226都属于弱酸性阳离子交换树脂。,(4)弱碱型阴离子交换树脂 (WAX) 基团的电离能力弱，和弱酸型阳离子树脂一样，电离程度受溶液pH变化的影响很大，其交换能力随溶液pH的降低而增大，在碱性溶液中几乎不发生交换反应。所以交换反应必须在pH7的溶液中才能正常进行。,含有 -NH2，NH，等基团的阴离子交换树脂。国产树脂中弱碱330（上海树脂厂# 701）、弱碱3112（上海树脂厂#704）、

24、华东弱碱阴32l、弱碱性# 301（南开大学树脂厂）、弱碱性330（同1）和国外产品Ambertite IR4B、Wofatit M、wofatit N、LewatitM、Dowex3、Fermutit W等都属于此种。其基本结构如下。含有-NH-基团的碱性较强，含有NH2或NH的碱性较弱。这种树脂有黄、橙、黑等颜色。,强性和弱性离子交换树脂的区别： 交换速度不一样：强酸和强碱性树脂交换快 转型时体积变化不一样：强酸和强碱性树脂由游离型转为盐型时，体积变化小，水洗容易达到中性；弱酸和弱碱性树脂由游离型转为盐型时，体积显著变化，水洗不容易达到中性；但是强酸性树脂的由盐型转为游离型时需要大量的酸处

25、理。,二、填料,1、配基和交换基团 离子交换色谱法，在早期都采用高分子聚合物，如苯乙烯二乙烯苯为基体的离子交换树脂作固定相。因这种固定相具有膨胀性、不耐压、表面的微孔型结构影响传质速率，所以在高效液相离子交换色谱法中已被离子型键合相所代替。,最常见的离子型键合相是以薄壳型或全多孔微粒硅胶为载体，表面再经化学键合成各种离子交换基团。 阴离子键合相常用强酸性磺酸型（SO3H），而阳离子键合相常用强碱性季铵盐型（N+R3Cl-）。 国产的离子化学键合相有YWG-SO3H、YWG-N+R3Cl-和YSG-SO3H、YSG-N+R3Cl-。,2、填料的交换容量和吸附容量,填料的柱容量：可用交换容量或吸附

26、容量表示。 （1）离子交换容量 用单位量的填料含有可交换基团的数量表示。其单位：微摩尔/克（mol/g）或 微摩尔/毫升（mol/mL）。 （2）柱子吸附容量 在特定色谱条件（动态或静态）下，填料吸附某样品组分的最大量。用mg/g、g/L或mol/g、mol/mL表示。吸附量是可变的：其值随测定方法、流动相的成分和样品的变化而变化。,（3）交换容量与pH值的关系,交换容量受溶液pH值的影响很大，特别是弱离子交换色谱填料。因为它们的交换基团需要在一定的 pH值条件下才能完全电离，故受 pH值的影响更大。见图7-3。,图7-3 PH值对交换容量的影响,由图可知： 强阳离子交换色谱填料 pH 1时才

27、有明显交换容量，pH大时，交换容量几乎不再变化；而弱阳离子交换色谱填料pH 6时才有明显交换容量，且PH越大，交换容量越大。 强阴离子交换色谱填料，pH 10时才能使用；而弱阴离子交换色谱填料，pH8时才有明显交换容量，且PH越小，交换容量越大。 由上可知，强阳和强阴离子交换色谱填料，具有比弱阳（阴）离子交换色谱填料更大的pH值使用范围，能适应较多的化合物在不同的 pH条件下进行分离或使用 pH梯度进行洗脱，所以应用较广。但是对于一些保留太强的样品，选用弱离子交换色谱填料更方便些。,三、IEC的保留机理（起主要决定作用的：静电力）,将交换基团和样品分子近似地看作为两个点电荷，它们之间的作用力

28、F 为： F=q1q2 / r2 式中q1、q2分别为两个点电荷电量；为介质的介电常数；r为两点电荷之间的距离。 在IEC中，交换基团的大小及电荷在固定pH值条件下是不发生变化的，所以样品组分与交换基团的作用力 F 随样品组分的带电情况及作用距离的不同而变化。正是这种各组分与交换基团之间有不同的作用力而使它们得以分离。,分析保留值大小,在离子交换色谱中，如果流动相的pH 值改变，就会改变样品分子的电离平衡，从而改变样品组分的带电情况，使保留值发生变化。 在阳IEC中，样品组分应该带有正电荷，多是由于样品分子中含有各种氨基形成的正电荷。离解平衡： R-NHR+ H+ RN+H2R 而在阴IEC中

29、，样品分子应该带负电荷，多是由于羧酸根或其他酸根离解形成的负离子。离解平衡： RCOOH R COO- + H+ 可见，在阳IEC中，当pH值减小时(即H+浓度增大)，促使样品组分形成更多的正电荷。这会使样品组分对阳离子交换剂表面带负电的交换基团亲合力增加，使保留值增加。 在阴IEC中，当pH值增大时( H+浓度减小)，促使样品组分上酸根的离解，形成更多的负电荷，因而使样品组分对阴离子交换剂表面带正电的交换基团亲合力增加，使保留值增加。,问题：当样品为蛋白质时，分析蛋白质在阴、阳离子交换色谱中，PH值改变对保留值影响。,注意：在选择弱阴、阳离子交换填料时，既要考虑填料在一定PH值下的离解度（P

30、H越小：WAX离解度越大，WCX离解度越小），又要考虑在一定PH值下流动相的保留值（PH越小：阳IEC中保留越小，阴IEC中，保留越大）。这两个是矛盾的。在选择条件时要注意，特别是流动相PH的确定。,对于两性蛋白质无上面的注意事项，阳离子不行就选阴离子交换填料。,图7-4 蛋白质的保留值()与其表面 纯电荷()及流动相PH的关系示意图,四、离子交换色谱条件的选择,样品在溶液中能形成离子，则首选离子交换色谱。 1、柱子的选择 离子交换色谱的柱子的选择比其他色谱法更复杂。因为交换基团有四种类型。样品的离解也有不同方式，所以要根据样品和实验室条件选择适用的柱子。选择柱子时可遵循下列原则： （1）根据

31、实验室条件和实验要求 定性、定量还是分离。 分析型柱子：内径48mm,长度525cm,流速0.5-3ml/min。(定性、定量用硬基质填料) 分离可以用高分子球基质。,(2)按照样品的性质,含有各种氨基（-RNH2，-NHR，-NR2）的组分，可在溶液中接受质子，形成正离子，所以要用阳离子交换色谱柱子分离。 含有各种羧基的化合物，可以在溶液中放出质子，形成负离子，所以要用阴离子交换色谱填料。 等电点PI值大的蛋白质，易形成阳离子，可优先选用阳离子交换色谱；等电点PI值小的蛋白质，易形成负离子，可优先选用阴离子交换色谱。,一般小分子，选一般填料。而蛋白质等分子量很大的化合物，选用大孔径填料(常用

32、内孔径在25-50nm)。,(3)填料孔径的选择,2、流动相选择,盐水 组成的溶液。（盐溶于水以后形成的离子作为样品组分的顶替离子） 洗脱强度：由顶替离子的浓度定。浓度越大，洗脱能力越强。 对样品及仪器无损害。例：NaCl作为流动相时，Cl对不锈钢有腐蚀性，要控制使用。,对样品溶解度无影响。所以常用具有缓冲作用的盐 梯度洗脱：盐浓度由弱强。改变洗脱强度可以浓度梯度或PH梯度。 3、检测条件的选择 参见反相色谱部分。 4、其他条件的选择 操作温度一般选用室温，,五、影响离子交换的有关因素 1、溶液的酸碱度 交换溶液中氢离子的浓度显著增高时，会抑制阳离子交换基团的电离和目标离子的交换反应。通常强酸

33、性交换剂交换液的pH应大于2。弱酸性交换剂的交换液pH应在6以上。 同样在阴离子交换剂中，强碱性交换剂的交换液的pH应在12以下，弱碱性应在7以下。,2、目标离子的交换性能： 主要取决于母体化合物的解离、目标离子的电荷、半径及酸碱性的强弱。解离常数大，酸碱性强者置换容易，但洗脱相对来说较难。离解离子价数愈高，电荷愈大，则它的引力愈强，愈易交换在交换树脂上。碱金属、碱土金属及稀土元素还与它们的原子序数有关，碱金属原子序数大，则交换吸附就强，稀土元素的原子序数小，其交换吸附强。,3、被交换物质在溶液中的浓度 离子交换操作通常是在水溶液或含有水的极性溶剂中进行，这样有利于离解与交换。浓度越低，离子交

34、换剂的选择性大。浓度过高，将降低物质的解离，有时会影响吸附次序及选择性。另外，还会引起树脂表面及内部交联网孔收缩，影响离子进入网孔。所以一般实验操作时所用溶液的浓度应该略稀，有利于提取分离。,4、温度的影响 温度的改变对稀溶液的离子交换性能影响不大，但在0.1mol/L以上浓度时，温度升高对水合倾向大的离子容易交换吸附。同时离子的活性系数增大，对弱酸、弱碱交换剂来说其交换率有较大的影响。一般温度增高，离子交换速度加快，在洗脱时亦可提高洗脱能力。但对不耐热的交换剂应注意提高温度的条件，避免引起交换剂的破坏。 5、溶剂的影响 通常在水中进行交换，亦可采用含水溶剂，但在极性小的溶剂中难以进行或不进行

35、交换，同时还导致离子交换的选择性的降低或消失。,表1 离子交换树脂干燥的临界温度,六、树脂的预处理及再生 （1）树脂的选择与准备： 选择树脂类型时，首先必须了解其性能如交换量的大小、颗粒大小、耐热性、酸碱度，然后进行预处理。普通的树脂，粒子都较大，大部分是3520目（0.490.83毫米），亦有50目，可作为植物成分的粗提及初步划分，但不适用子离子交换层析。离子交换层析一般需要较细的树脂，因此需要把它干燥，粉碎后，过筛或利用浮选法进行选择。,（2）预处理 除去可溶性小分子有机物和铁、钙等杂质。首先把新树脂浸在蒸馏水中12d，使它膨润后，装在层析管中，按下法处理： 强酸性阳离子交换树脂的预处理：

36、 新树脂一般是Na型。先用树脂体积的20倍的2mol/L盐酸以1ml/(cm2min)左右的速度进行交换，使它变为H型后用水洗到流出液呈中性，然后用树脂体积的l0倍量的1mol/L氢氧化钠（或食盐）进行交换，使它变为Na型。再用水洗到流出液不含Na为止（焰色反应无黄色）。再重复一次盐酸氢氧化钠（或食盐）处理。最后用树脂体积的10倍量的lmol/L盐酸进行交换，使它变为H型，然后用蒸馏水洗到流出液呈中性为止。,强碱性阴离子交换树脂的预处理： 新树脂一般呈Cl型，依次用树脂体积的20倍的1mol/L氢氧化钠溶液（使它变为OH型）洗涤树脂体积的10倍量的水洗涤用树脂体积的lO倍量的lmol/L盐酸溶

37、液洗涤（使它变为Cl型）用蒸馏水洗至流出液近中性为止。再重复一次氢氧化钠盐酸处理。最后用树脂体积的10倍量的1mol/L氢氧化钠溶液进行交换，使它变为OH型。OH型树脂容易吸收空气中二氧化碳，因此保存时要注意，临用时把C1型的树脂变为OH型较好。,弱酸性阳离子交换树脂的预处理： 新树脂一般是Na型。依次用树脂体积的l0倍量的lmol/L盐酸溶液（使它变为H型）用水洗到流出液呈中性为止用树脂体积的10倍量的lmol/L氢氧化钠溶液（使它变为Na型，此时体积膨胀）用树脂体积的10倍量的水洗涤至中性。如果流出液仍然呈弱碱性。再重复一次盐酸氢氧化钠处理。最后用树脂体积的10倍量的1mol/L盐酸溶液使

38、它变为H型。用水洗到中性。,弱碱性阴离子交换树脂的预处理： 新树脂一般是Cl型。预处理与强碱性阴离子交换树脂基本相同。变为Cl型后，用水洗涤时因为水解的关系不容易洗到中性。一般用树脂体积的l0倍量水洗涤就可以。除盐酸外有时也用硫酸，也可用氯化铵代替氯化钠。交换终点可以用以下方法来判定。请参考下表。,表2 树脂预处理终点交换点的判断,（3）再生： 用过的树脂，如还要交换同一种样品，把盐型变为游离型即可。如要交换其他样品，要用预处理的方法再生。不用时加水，保存在广口瓶中。若遇耐热性离子交换树脂，则可在加温条件下处理，市售商品往往是湿的，若遇到干燥状态的树脂时，不要马上加水，这样易引起龟裂，影响物理

39、性能。可先加饱和氯化钠湿润后再按前述方法处理或再生。,七、实验技术 关于树脂量、层析管的粗细、展开溶剂量和流速的关系，可以参考下表。,表3 酚磺酸型阳离子交换柱的操作条件,表4 苯乙烯强酸型阳离子交换柱的操作条件,表5 强碱性阴离子交换柱的操作条件,装柱：把树脂放在烧杯中，加水充分搅拌，将气泡全部赶掉。放置几分钟使大部分树脂沉降，倾去上层浮粒和微粒，反复上述操作到上层液透明为止。粒度小的树脂，搅拌后要放置稍久，因为较难沉降。如果急于倒水，往往损失较大。 将准备好的树脂，加少量水搅拌后一次性倒入保持垂直的层析管中，使树脂沉下，让水流出。注意不要让气泡进入树脂中。,加样：加样时要注意不要把树脂冲散

40、。放一块玻璃浮球或一层玻璃丝即可。样品量与树脂量的比例：每一种树脂都有一定的交换容量（1克干燥树脂理论上能交换样品的毫克当量数），如国产弱碱330树脂的交换当量为9（毫克当量克），强碱2014为3.5，强酸17为4.5等。强酸l7的4.5毫克当量克，就是说这种树脂的l克能够交换丙氨酸89.09 4.5毫克（注：丙氨酸的分子量为89.09）。 如果用阳离子交换树脂，样品可以加到全交换当量的l/2。用阴离子交换树脂，样品可以加到全交换当量的l/41/3。样品和树脂量的关系：要注意柱子上的吸收带长度不超过层析柱长度的1/10。,八、 离子交换法的应用 离子交换法可用于分离氨基酸、肽类、生物碱、有机酸

41、、酚类等天然化合物。 常用于有效部位的分离：一般可用水提取液通过强酸性（磺酸型）树脂，再通过强碱性（季铵型）树脂，分别洗脱，分成酸性、中性、碱性部位。 生物碱的分离：可用强酸性树脂从中草药水浸液或稀酒精提取液或酒精提取部分的水溶部位直接交换生物碱，用氨水或氨性酒精洗脱，所得部位，再用其他分离手段分离。此法由于树脂可反复使用，特别对水溶性生物碱的提取分离，较经典方法有利。 用于有机酸及酚性物质的提取分离： 氨基酸的提取分离：一般利用不同pH的缓冲液梯度洗涤达到分离目的。,7-5 排阻色谱法（SEC）,凝胶色谱法是上世纪60年代发展起来的一种分离分析技术，有多种名称如凝胶色谱 分子筛色谱 尺寸排阻

42、色谱等使用的固定相是凝胶。凝胶是具有许多孔隙的网状结构的固体，有分子筛的性质。,一、基本原理 当被分离物质的分子大小不同时，能够进入到凝胶内部的能力也不同。凝胶中的孔隙大小与分子大小有相仿的数量级。当混合物通过凝胶时，比孔隙小的分子可以自由进入凝胶内部，而比孔隙大的分子就不能进入，因此在移动速度方面就出现差异，从而使不同相对分子质量的各组分得到分离。,图7-5 凝胶色谱法的原理,其分离原理可用下式表示： VR = V0 + kVi VR：保留体积（洗脱体积） V0：柱床内存在于凝胶外面的水相体积外水体积 Vi：凝胶颗粒内部所含的水相体积内水体积 k：分配系数,被分离物质分子很大，被完全排阻于凝

43、胶颗粒之外：VR = V0 ，k = 0； 被分离物质分子很小，能完全自由进入凝胶颗粒内部：VR = V0 + Vi ，k =1 中等大小的分子，只能达到部分凝胶颗粒内部：V0 VR V0 + Vi ，0 k 1 二、凝胶的种类 具有分子筛效应的凝胶，主要有葡聚糖（商品名为Sephadex）、琼脂糖（商品名为 Sepharose） 聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel）及具有一定网眼的玻璃珠。还有这些凝胶的衍生物。最常用的是葡聚糖凝胶。,1.亲水性凝胶 (1)葡聚糖凝胶 蔗糖发酵葡聚糖（ -1,6-苷键） 交联剂环氧氯丙烷与葡聚糖发生交联反应 生成多孔性网状结构的葡聚糖凝胶(其结构见下页)

44、（商品名：Sephadex）。 环氧丙烷是引入甘油基将各个多聚葡萄糖单位交联起来，凝胶网眼的大小由多聚葡萄糖的分子量和制备时环氧氯丙烷的用量决定的。,葡聚糖的特性与类型：亲水性较强，在水和电解质溶液中膨胀成为柔软而富于弹性的胶体。其吸水能力与葡聚糖凝胶的交联度有密切关系。交联度大的，孔径小，吸水少，膨胀的程度小；交联度小的，孔径大，吸水多，膨胀的程度大。因此，葡聚糖孔径大小可以其吸水量的大小来表示，常以G-10至G-200号码标记。G后面的数字是其吸水量（mLg-1干胶）乘以10所得的值。如G-25即表示吸水量为2.5。市售有G-10、G-12、G-25、G-50、G-75、G-100、G-1

45、50、G-200等型号。G-75以上的凝胶因吸水量大，膨胀后形态柔软易变，统称为软胶。G-75以下的称为硬胶。,表6 交联葡聚糖的性质,凝胶层析是一种物理分离法。葡聚糖基本上不带电荷、呈惰性，不与被分离的物质发生反应，所以分离的效果较好。然而由于是葡萄糖的聚合物，因而仍有少量的活性羟基，能吸附少量蛋白质等被分离的物质。为了克服这个缺点，一般使用含有离子强度达0.08的NaCl等中性盐作洗脱液。 （2）其它 聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel）、琼脂糖凝胶（Sepharose）等，适合于分离分子较大和不溶于水的化合物。,2.疏水性凝胶 在交联葡聚糖凝胶分子上引入一个基团，增大其亲脂性，便得到疏水性凝

46、胶。例如，在Sephadex G-25分子上引入羟丙基（ROH ROCH2CH2CH2OH），得到疏水性凝胶：葡聚糖凝胶LH-20，既有亲脂性又有亲水性，可用于分离酯类化合物、类固醇等。,三、操作方法 1.凝胶的选择 一般根据凝胶的分离范围进行选择。如果分离相对分子质量相差悬殊的组分：例如脱去蛋白质溶液中的盐类，可选择型号较小的凝胶（G-10，G-15，G-25），颗粒为100150目。 分离相对分子质量比较接近的组分，凝胶颗粒要细（200目）且大小要近乎均一。 2.装柱 凝胶用水或缓冲液浸泡使其充胀用流动相浸泡装柱,（1）凝胶溶胀（水化） 商品葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶均为干燥颗粒。使用前必

47、须水化溶胀。商品琼脂糖凝胶呈悬浮胶体可直接使用，玻璃珠无需溶胀。 凝胶溶胀有两种方法： 室温溶胀 沸水溶胀 注1：各种葡聚糖凝胶在两种溶胀方法中所需的时间不同。必须浸泡足够的时间以便凝胶充分溶胀。两种方法中，沸水溶胀不但节省时间，还可以杀灭凝胶中污染的细菌并排除气体。,注2：凝胶溶胀后，需用蒸馏水洗涤几次，每次应将沉淀缓慢的细小颗粒随水倾去，以免在装柱后产生阻塞现象，降低流速，洗涤后将凝胶浸泡在洗脱液中待用。 柱子大小和凝胶用量的确定： 称取1g所需型号的葡聚糖干胶，放在5mL的量筒中，用室温溶胀的方法充分溶胀，观察溶胀后凝胶的体积。然后在层析柱中加水到所需的柱床高度，将水倒出，量取体积。根据

48、1g干胶溶胀后的体积和所需柱床体积，即可推算出干胶的需要量。,（2）装柱子 装柱的操作过程如下：将层析柱垂直固定在铁架上，打开柱下口开关。将溶胀好的凝胶放在烧杯中，使凝胶表面的水层与凝胶体积相等。用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻璃棒灌入柱内。此时柱下口一边排水，上口一边加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地沉降，逐步形成凝胶柱。当到达所需凝胶高度时，立即关闭下口，使凝胶完全沉降。凝胶柱一般离柱顶35cm，以覆盖一层溶液。,柱子、凝胶类型、用量和上样量的关系： 凝胶层析中，在把小分子物质（MW20 000）分离时，层析柱的体积一般约为样品的410倍，高度与直径的比例为51至151之间。这类柱也称为“脱盐柱”

49、。常用网眼很小的凝胶如G-25。用以将生物大分子物质彼此分开的分级层析柱，体积应为样品体积的25100倍。柱长度与直径的比例为2011001。,装柱操作注意事项： 灌注凝胶时要求将均匀的凝胶一直加到所需柱床高度，不能时断时续，否则将出现分层或“纹路”等毛病。若出现这些现象，可以用玻璃棒将已经形成的柱床逐步搅起，直至出毛病的地方，再继续加入搅匀的凝胶悬液。若在罐好凝胶后才发现“纹路”、分层等现象时，要重新装柱，以免影响层析效果。在做大型的凝胶柱时，灌注的凝胶是否均匀往往从表面上看不出来。所以使用前应用一些带色的大分子物质如细胞色素C、血红蛋白或专用的蓝色葡聚糖2 000（Blue dextran

50、-2 000）通过凝胶柱，以检查形成的带色斑带是否整齐，若斑带歪斜，应该重新装柱，直至达到要求。,注1：刚从冰箱中取出的凝胶液，不能马上用来灌柱，应平衡至室温后再用，不然装好的凝胶柱会产生大量的气泡影响层析。 注2：在整个灌注凝胶的过程及使用中，凝胶柱面上一定要覆盖着一层溶液，以免进入空气。若进空气，在加入溶液时，凝胶柱中易形成气泡。 注3：装好的凝胶柱，使用时应该用相当于柱体积两倍或更多的洗脱液流过洗脱柱，以压实凝胶。,3、上样 上样时，应该注意上样量的多少，样品的粘稠度及离子强度。这三个因素会影响到以后层析的效果。一般来说“脱盐”层析时，上样体积可为柱体积的10%25%；生物大分子的分级分

51、离，约为柱体积的1%5%。样品的粘稠度一般不宜大于洗脱液粘稠度的2倍以上，不然洗脱峰会变宽和歪斜。离子强度要达到0.08，以免产生机械性吸附。,上样操作： 打开层析柱的下口开关，放出凝胶柱面上的多余溶液，或用橡皮头吸管吸取，使液面与凝胶表面相平齐。 将样品加在凝胶表面，打开下口开关，控制流速，使样品慢慢渗入凝胶内。当慢慢渗入凝胶的样品溶液面与凝胶柱面相平齐时，关闭下口，完成上样。然后在凝胶柱面上加一层（35cm）洗脱液，接上洗脱瓶准备洗脱。 注1：切忌液面低于凝胶表面 注2：勿将凝胶柱面冲起形成凹面，也不能沿管壁流下，以免样品沿柱壁与凝胶的间隙漏下。,4、洗脱 （等浓度洗脱） 洗脱过程中保持恒

52、定的流速是获得良好分离效果的重要条件。因为凝胶层析的分离作用主要取决于分子扩散进入凝胶的机会，流速过快有些分子来不及在分子筛中分配而流出；过慢时已分离的分子会因扩散而混合。因而要保持适当的恒定流速。洗脱液的流速取决于它的静水压（指洗脱液的液面高出层析柱出口液面的高度）（或接触空气的两个液面间的高差）。静水压越大，流速就越快。实验室通常用马氏瓶来控制流速，注意不要让瓶中的液面低于玻璃管的下口。,图76 恒压洗脱装置,注1：对于G-75以上的软胶来说，每种凝胶都有自己的所能承受的最大静水压，如果静水压超过凝胶的承受能力，凝胶将发生变形而被压紧，流速也会随之降低。 注2：用试管分步收集色谱柱的流出液

53、，分别测定各管光密度，并以其为纵坐标，以收集管的顺序号为横坐标，在坐标纸上绘图，获得具有洗脱峰的曲线即洗脱曲线（图7-7）。相邻峰交叉越少表明分离效果越好。,图7-7 洗脱曲线示意图,5、凝胶的洗涤与保存 再生：一般只要用洗脱液冲洗后即可连续使用。 若凝胶颗粒沉积压紧，流速减慢，则需倒出，清洗后重新装柱。有微量污染可用0.9mol/L氢氧化钠（内含0.5mol/L氯化钠）处理冲洗，再用水洗至中性。凝胶色泽改变，流速降低，表面有污染物等时，常用温热（50左右）的0.5mol/L氢氧化钠和0.5mol/L氯化钠混合液浸泡，再用水洗净。 短时保存：可浸泡在溶液中，存放在4冰箱中。若放在室温保存应加入

54、0.02%叠氮化钠（NaN3）或0.01%乙酸汞等防腐剂，以防发霉。用时以水洗去防腐剂即可使用。 长期保存：可用水洗净，分次加入百分浓度递增的乙醇脱水，最后再用乙醚除乙醇，烘干即可。,四、应用 特适合于大分子量的聚合物、蛋白质、核酸等的分析。 对样品要求：可溶于流动相中。 1.脱盐 25克固体葡聚糖凝胶 + 0.05MpH = 7.2的Tris缓冲液（2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇-盐酸缓冲液）充胀 装柱（待脱盐的蛋白质溶液体积 = 1/5柱床体积）加样 用上述缓冲液洗脱 紫外分光光度计（ =280nm）检测洗脱下来的蛋白质。,2.酶解产物在Sephadex G-50柱上的预分级分离 一

55、种普通的蛋白质如果通过一些特异酶或化学方法进行降解，则会生成相当复杂的肽混合物。为了进行结构研究，必须分离和纯化“粗”水解产物中构成多肽链的所有肽，这是件非常复杂的工作。因此，“粗”水解产物必须进行预分级分离。在现代方法中，凝胶过滤最适于此种目的。,将凝胶与4份0.01molL氨水溶液在室温搅拌30min，然后沉降，倾去细颗粒的上层液。沉降的葡聚糖凝胶G-50再与约3份0.01molL氨水溶液搅拌并倒入柱中。柱用5倍与床体积的0.01molL氨水溶液洗涤。将200mg被分离物质溶于35ml 0.01mol/L氨水溶液中，让样品慢慢吸入凝胶柱中，用0.01mol/L氨水溶液洗脱，流速250300

56、 mlh，收集各管在紫外280nm处有吸收的洗脱液，合并，冷冻干燥。,2,7- 6 高效液相色谱的实验技术,一、柱技术 液相色谱柱是色谱的关键部件，应该了解柱子结构、填料性质、装柱操作和保养维持技术。 1、装填（用“高压匀浆法”装填） （1）装柱机的准备 高压匀浆法装柱的装填机及配套流程见图7-8。,图7-8 色谱柱的高压匀浆法装填,（2）柱子的清洗：有两种清洗法可供选择。一是有机溶剂清洗法，柱子依次用二氯甲烷、丙酮、水洗洗干净。二是酸洗法，把柱头及柱管放在1：1的硝酸中超声20-30min，再用清水超声处理几次，至洗涤的水显中性。 （3）装柱条件的选择：装柱条件主要是装柱压力(是使用压力的几

57、倍)、装柱时间(在20-60min之间 )、匀浆的体积(随机附有匀浆管)等。 （4）匀浆的配制：装柱的填料要用一定的溶剂使其分散制成匀浆。装反相色谱柱常用四氯化碳和二氧六环（约2：1）。装流动相是盐水溶液的填料可用异丙醇。,方法：先称取所需填料量的1.1-1.2倍，加入与匀浆管体积数相等量的分散溶剂，超声2-3min，使填料分散均匀，并尽可能地赶去填料孔内气泡。将清洗过的柱子一头柱头装好，另一头柱头卸下，将柱子装在匀浆管上，然后将匀浆从超声器上取出倒进匀浆管。此时，匀浆应充满整个匀浆管。接上管子后马上开泵装柱。 （5）装柱：装柱过程中不能停顿，以免装填不匀。 方法：装柱时间到了以后，不能马上拆

58、下柱子。应关阀门，然后等待5-20min，让柱内压力自然降低，柱子出口不再滴液时方可拆下柱子，装上柱头。并拧上两头的密封螺丝。,2、柱子的保养,柱子不用时，用不会长霉菌的液体充满柱内，并拧紧两头密封螺丝。常用的封存液有：甲醇、50%甲醇、万分之二的叠氮化钠水溶液。 3、柱子堵塞的处理 柱子堵塞经常是柱子入口端筛板被杂质堵塞。可以拆下入口端柱头，用可以溶解杂质的溶剂超声或煮沸处理；也可以用1：1的HNO3煮30min。 4、柱子填料凹陷 打开柱头，用同种填料在湿润下填平即可,二、洗脱方式,洗脱方式有三种：等浓度洗脱、梯度洗脱、脉冲洗脱。 等浓度洗脱：是流动组成、pH值、流速不变化的洗脱方式。（使用示差检测器时，or在排阻色谱中，只能使用等浓度洗脱。） 梯度洗脱：在一次分离中用改变流动相组成或pH来逐步增加流动相洗脱能力的洗脱方式。（梯度洗脱用两种洗脱液，分A液和B液。A液洗脱能力弱，B液洗脱能力强。洗脱开始时用A液，然后根据梯度洗脱程序自动向流动相中添加B液，增大洗脱强度。）（使用紫外检测器和荧光检测器时的反相色谱和离子交换色谱中可以使用梯度洗脱。一般，在样品组分较多，组分之间容量因子K或保留时间相差大时，应该使用梯度洗脱，否则保留强的溶质峰太宽或者某些峰分离不开。） 脉冲洗脱：用一段少量的洗涤剂，让它象一条密集的脉冲带流过柱子，以洗下某个特定物质。（这种方法适用于很昂贵洗脱