修饰引物十问十答

1、修饰引物十问十答修饰引物使用的原料是一般引物原料的几百倍，所以产品的价格自然高。3. 合成的荧光标记探针应如何保存?1）荧光探针必须避光保存。2）干品可于-80保存一年以上，无条件时可于-20保存。3）强烈建议用rnase-free的te (ph 8.0) buffer溶解探针，这样得到的探针溶液更稳定，保存时间更长。4）可将探针配制成100 pmol/l的储备液，分装成几份于-20 保存。使用前，将配制好的储备液稀释成工作液 (10 pmol/l或20 pmol/l)，剩余部分于-20 保存，防止反复冻融。4. 修饰标记对od值的测量有影响吗?有些荧光基团在260 nm处也有吸收光，例如 f

2、am, hex, tamra, tet。其它在260 nm处可能也有吸收值，但是数据没有公布，因此计算时不包括在里面。5. 磷酸化是怎么回事？5磷酸化作用是通过b-氰乙基化学反应添加到引物5端的糖环上，而不是最后一个碱基上；3磷酸盐被连接到固体支持介质上，所以在合成的第一个循环，碱基就与它偶联。3磷酸化修饰具有阻止聚合酶延伸的功能。6. phospothioate(s-oligos)硫代引物和普通的引物有什么区别?s-oligos是寡核苷酸中的单核苷酸之间的磷酸二酯键中的一个氧被硫代替后形成的。这种修饰是在连接的时候进行的（不是在合成后进行的）。碱基被添加上后，再进行连接修饰。在两个碱基之间的

3、磷酸可以转换成双键s(用硫代试剂）代替普通的双键o（用碘溶液），和磷酸二酯键相连的碱基都可以进行这种修饰。7. 氨基修饰的原理是什么？注意事项是什么?5aminolinker(c6)是在合成循环的最后一步以亚磷酸胺的形式通过b-氰乙基化学反应添加到引物5糖环上的，而不是添加到最后一个碱基上。5氨基标准的偶联效率是95%,氨基基团在260nm处是没有吸光值的；它在210nm处有吸光值。不能通过电泳检测它的存在（琼脂糖或丙烯酰胺）。3aminolinker(c7)只与一些5修饰兼容，如fam, hex, tet, fluorescein, biotin, amine, and phosphate。

4、其它的5修饰(如alexa dyes)需要氨基才能与寡核苷酸相连，这就无法避免该染料与3氨基相连。8. 常见的荧光染料有哪些？缩写全名吸收波长发射波长颜色6-fam6-carboxy-fluorescein494 nm518 nmgreentet5-tetrachloro-fluorescein521 nm538 nmorangehex5-hexachloro-fluorescein535 nm553 nmpinktamratetramethyl-6-carboxyrhodamine560 nm582 nmroserox6-carboxy-x-rhodamine587 nm607 nmredc

5、y3indodicarbocyanine552 nm570 nmredcy5indodicarbocyanine643 nm667 nmviolet9. 淬灭基团为tamra、eclipse或bhq系列染料的双标记荧光探针在使用上有什么不同?由淬灭基团tamra、eclipse或bhq系列染料组成的双标记荧光探针常常被用作水解探针(hydrolysis probes)，或称taqman探针，用于实时荧光定量pcr实验。1) tamra为荧光染料，在淬灭报告基团的同时，会在更高波长处发射荧光。而eclipse及bhq系列为非荧光染料，淬灭报告基团时，自身不发射荧光，探针荧光本底比tamra低，检测灵敏度更高。2) tamra的吸收光谱覆盖范围窄，可与之匹配的报告基团种类较少；而eclipse则具有更宽的吸收范围(390 nm-625 nm)，可淬灭的报告基团种类很多，如fam、hex、tamra、rox等均可；组合使用的bhq系列染料的吸收光谱覆盖范围则更广，从430 nm一直到近红外，可淬灭的报告基团种类更多，包括cy3、cy5等。因此可由eclipse或bhq系列染料组成一套双标记荧光探针用于多重pcr。hextetfam10. hex, tet or 6-fam几种的区别是什么样的？hex,tet and fam是在合成循环结束时以亚磷酸胺的形式通